蛋白相互作用检测——免疫共沉淀(CoIP)

免疫共沉淀（CoIP）

一、CoIP原理：

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。当细胞在非变性条件下被裂解时，细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被完整的保留了下来。当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行检测，进而证明两者间的相互作用。

免疫共沉淀原理示意图

二、实验步骤：

1、实验前准备如下： 预冷PBS，RIPA Buffer，预冷离心管、细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），预冷离心机；

2、将细胞培养板中的细胞置于冰上预冷，然后使用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；

3、根据不同的细胞量加入适量的预冷RIPA Buffer裂解细胞(1 ml/107个细胞、10 cm培养皿或150 cm2培养瓶，0.5 ml/5×106个细胞、6 cm培养皿、75 cm2培养瓶)

4、将细胞在冰上放置5-10 min，然后使用移液器轻轻吹打细胞，如果细胞没有完全裂解，可以使用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到预冷的1.5 mL EP

管中，4℃，缓慢晃动15 min（EP管插冰上，置水平摇床上）

5、4℃，14000 rpm离心15 min，立即将上清转移到一个新的预冷离心管中，同时取少量裂解液以备 Western blot 分析；

6、剩余裂解液中加入1 μg 相应的抗体，4°C缓慢摇晃孵育过夜；

7、取10 μl protein A 琼脂糖beads，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min；

8、将预处理过的10 μl protein A 琼脂糖beads加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中，4℃缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖beads偶连；

9、免疫沉淀反应后，在4℃条件下以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖beads用1 ml 裂解缓冲液洗3－4 次；最后加入15-20 μl 的1×SDS上样缓冲液，100℃煮5 min；

10、SDS-PAGE, Western blotting 或质谱仪分析。

免疫共沉淀实验步骤示意图

三、免疫共沉淀实验方法的优缺点：

其优点为：

（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；

（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；

（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

其缺点为：

（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；

（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；

（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

四、注意事项：

1、 细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40 或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。

2、使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用；

3、使用对照抗体：

单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗

兔多克隆抗体：正常兔IgG

4、在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性，应注意以下几点：

1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；

2) 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；

3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。