收藏|疏水层析的应用实例(上)

2023-05-10 14:56:27



疏水层析技术最大的优点是与蛋白质的作用比较温和,能更好地保持生物大分子的天然结构和生物活性。此外,“高盐吸附,低盐洗脱”的特点使其能直接与其他层析分离技术如盐析离子交换、亲和层析、凝胶过滤等工艺联合使用。这些特性决定了该项技术在分离纯化中的特殊地位。目前在生化分离中已获得了广泛应用,尤其对于分子量较大活性大分子的分离纯化已成为独立的操作单元,在基因工程、生物制药等领域成为制备工艺中重要的组成部分。


目前以琼脂糖系列衍生物为工业应用中的主要分离介质,以弱疏水性的C4-琼脂糖,强疏水性的C8-琼脂糖,中等疏水性的苯基琼脂糖是广泛应用的主要品种。其中苯基琼脂糖的疏水性适中,洗脱容易,不会导致生物制品的失活,已成为HIC技术中的首选分离介质。



应用实例


基因工程药物的分离纯化


疏水层析分离介质主要应用于重组人粒巨噬细胞集落刺激因子( GM-CSF)、粒细胞集落

刺激因子(G-CSF)、人集落刺激因子(M-CSF)、表皮生长因子(EGF)等物质的生产,以及单克隆抗体的纯化。


破伤风毒素的纯化


破伤风毒素是一种安全免疫制剂,为了避免接种时的不良反应,必须进行精制,去除非特异性蛋白质。采用疏水层析和离子交换层析,可以获得高纯度的破伤风毒素。主要操作步骤为

在室温条件下,将毒素滤液与2mol/L硫酸铵磷酸盐溶液等量混合。混合溶液经过苯基Seph

arose疏水层析柱,进行吸附。然后分别用1mol/L硫酸铵-磷酸盐溶液、0.5mol/L硫酸铵一磷酸盐溶液、50gmoL/L磷酸盐缓冲液洗脱。得到的洗脱液已经去除了大部分杂质,毒素得到初步纯化。再经 DEAE- Sephadex离子交换层析进一步纯化。用此方法连续纯化五批毒素,均获得高纯度的破伤风毒素。试验证明破伤风毒素经疏水层析和离子交换层析可得到有效纯化。经过疏水层析后,蛋白回收率为90%左右,比活为原来的6倍左右。经后续离子交换,使用该纯化工艺经五批试验,破伤风毒素总回收率为52%~73%。平均纯度达到2285Lf/mgPN,平均回收率为62.35%,制品色度比原工艺明显降低。结果表明,用疏水层析和离子交换层析两步法,工艺简单,疏水洗脱液可以直接或稍加稀释即可进入离子交换柱。该组合工艺使产品纯度得到了较大提高,成为可行的生产方法。



重组乙肝病毒表面抗原的纯化


为使我国自主知识产权产品CHO细胞表达的乙肝疫苗产业化,从细胞培养物中提取纯化表达的 HBsAg,成为制备基因工程乙肝疫苗的关键技术,也成为分离纯化技术中研究的重点

目前已经采用多种组合工艺和层析技术进行产业化生产,产品的各项技术指标均符合《中国生物制品规程》要求。

对于 HBsAg分离纯化的主要层析技术为疏水层析、离子交换、凝胶过滤及PEG沉淀等层析组合分离技术。采用不同工艺进行分离纯化,实验表明各种组合工艺都获得了良好的算

果,各种工艺中都使用了疏水层析技术。疏水层析分离介质大都使用的是硫醚结构的丁基

糖, Butyl-S senagrose 4FE,采用以下主要工艺路线,培养液去除细胞残骸等颗粒物,调整言

当硫酸铵浓度,进行疏水层析,经过洗脱后,杂蛋白可基本去除。在适宜的上样流速和层析

度下,通过此步操作可去除96%的杂蛋白。活性物质回收率可达85%以上,纯化10-20倍。然后再进行阴离子交换、凝胶过滤,得到纯度、免疫原性和稳定性方面都能达到世界卫

生组织标准的乙肝疫苗。

       在乙肝疫苗的分离纯化中,中科森辉在乙肝疫苗的分离纯化中疏水及离子交换工艺全部使用了自制的分离介质,在中试实验的应用中取得了良好的效果。国内研制的介质均以粒径均一的国产高交联度快速流琼脂糖为基质,采用交联、活化、偶联等步骤合成了针对分离纯化CHO的丁基琼脂糖疏水层析介质。


天然资源中多种有效成分的提取分离


采用盐析与疏水层析结合工艺快速纯化激肽释放酶


激肽释放酶能使血管舒张并增加其通透性,促进脑及视网膜血流供应,具有易于被人体吸

收、长期使用安全等特点。主要工艺路线是将激肽释放酶粗品溶于10%饱和度的硫酸铵溶液中,收取硫酸铵70%饱和度沉淀物,溶解沉淀的溶液经过疏水层析柱进行吸附,用10mmol/L磷酸盐(pH6.5)缓冲液进行梯度洗脱,得到比活大于500U/mg的纯品。猪胰脏中还含有大量的胰酶、弹性蛋白酶、脂肪酶等,因此,疏水层析收集的非目标蛋白洗脱液还可用作分离纯化其他几种酶的原料。利用实验对辛基、苯基及丁基3种琼脂糖疏水层析介质进行了比较,实验表明,Ctyl- senagrose 4FF吸附蛋白能力最弱,在洗脱初始阶段,大部分蛋白即被洗脱下来;phenyl- senagrose 4FF吸附蛋白能力最强,洗脱液离子强度很低条件下大部分蛋白才能被洗脱下来,这两种介质对分离胰激肽释放酶的分离效果都不明显,而 Butyl- - senagrose 4FF介质疏水性适合,可以保证温和条件下洗脱胰激肽释放酶,并得到纯度较高的目标产品。


人血清白蛋白的提取分离



采用离子交换与疏水层析在常温下操作的联合工艺,可以从人血清中得到高纯度的人血清

白蛋白,纯度大于99%,工艺收率81.2%,与传统冷乙醇工艺相比,具有目标产品纯度高,

可常温操作,易于实现自动化控制的优点,主要工艺是冷乙醇沉淀,然后用凝胶过滤柱进行脱

盐、脱乙醇、更换缓冲液处理。经过阳离子交换柱(CM阳离子交换层析介质),吸附杂蛋白,进行初步纯化。实验筛选出丁基疏水层析介质 Butyl- Sepharose FF,在温和条件下与强疏水性的HSA结合,而进一步去除剩余的杂蛋白,得到纯品。因为HSA分子中疏水性氨基酸残基数约40%,表面具有较强的疏水性,所以用疏水层析进行分离是适宜的工艺过程。通过梯度洗脱得到纯度很高的目标产物。



疏水层析分离大豆凝集素


凝集素是具有糖结合转移性,可将细胞凝集的蛋白质或糖蛋白,在有机体中有多种重要的

生理功能和生物学作用,因此在化学、生物学、医学等多领域中有广泛的用途。大豆中含有丰富的凝集素,约占大豆蛋白的1.5%~3.0%,因此大豆凝集素(SBA)的分离成为引人注意的课题。以苯基一琼脂糖疏水层析介质进行分离,先用0.01mol/L磷酸盐-氯化钠的缓冲液PBS(pH6.8)进行浸泡、装柱,再用0.0lmol/LPBS(pH6.8,硫酸铵饱和度为60%)的缓冲液平衡层析柱。上样量为20mL大豆凝集素提取液,在20℃下,先使用硫酸铵饱和度为60%的0.0lmol/LPBs(pH6.8)溶液进行淋洗。然后将硫酸铵饱和度降为30%的缓冲液淋洗。最后用无硫酸铵的0.01mol/LPBS缓冲液淋洗,收集各级分淋洗液。测定活性,得到3个洗脱峰,其中第3个峰为目标产物,见图5-21。此峰中蛋白质的活性较高,经过疏水分离后,大豆凝集素的纯化倍数为35,活性回收率达100%,大豆凝集素中有亮氨酸、苯丙氨酸等多种疏水氨基酸,其含量高达41.5%,且凝集素的立体构型为β折叠。这种形状有许多裂缝,因此疏水基团暴露在蛋白质分子表面的机会很多,导致其与介质的疏水配基之间的疏水作用力比较强,易于使用疏水层析进行分离。凝集素的活性对温度和pH值的变化较敏感。因此,分离制备时必须在一定的缓冲液中低温下分离,以免凝集素失活。这种疏水层析分离方法简便可行。用疏水层析工艺,可以不考虑凝集素的糖类结合专一性,而以水作为洗脱剂,可以不使用价格昂贵的单糖,从而降低了成本。





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