耳聋蛋白质组学的研究及进展

   随着解剖技术和显微设备的发展，内耳中各部位、组织被精准地分离；分子遗传学的研究让人们对内耳的基因表达及与听觉相关的基因有了较为深刻的认识。这些成果推动着蛋白质组学应用于耳聋研究中，使遗传性耳聋、药物性耳聋、老年性耳聋、前庭神经鞘膜瘤、梅尼埃病中耳炎等疾病的蛋白质组学研究得以开展。蛋白质经过修饰（糖基化、磷酸化、甲基化）可以产生大量的新蛋白质，部分新的蛋白质发生蛋白质变性，与疾病密切相关。蛋白磷酸化引起活性及稳定性变化，出现生理或病理性效应，对耳聋发生具有较大的作用。蛋白质组学作为后基因组研究最重要的组成，比基因组的组成更加复杂、功能更加活跃，能更好的反映细胞的的动态变化和反应，因此蛋白质组学的研究成果将具有更好的应用前景。本文对耳聋蛋白质组学国内外研究及进展进行综述。

        1 蛋白质组和蛋白质组学

        蛋白质组( proteome ) 是由澳大利亚学者Wilkins和Williams提出的，指“一个细胞、一种组织、一个机体基因组表达的所有蛋白质”。蛋白质组学( proteomics )是研究和分析细胞、组织、机体中蛋白质的组成、功能及活动规律的科学。虽然细胞的基因组是相同的，但基因组的表达调控具有差异，产生的蛋白功能不同，因此形成功能不同的细胞。蛋白质与细胞功能直接相关，蛋白质组的变化能直接、有效的反映生物系统的状态。蛋白质组学的研究涉及三方面：蛋白质量化、蛋白质-蛋白质之间的关系，翻译、修改和蛋白质功能的关系。目前，在人体和小鼠内耳中，经蛋白质组学技术鉴定的表达蛋白质已经达到数十种。美国华盛顿大学建立了内耳蛋白质数据库（h t t p : / / oto .wust1，edu / thc / innerear2d . htm），可以查询到人体内耳数十种蛋白质。内耳功能障碍常与有缺陷的毛细胞相关，蛋白质组学技术可用于识别和分析内耳发育指标及其他已知的基因/蛋白表达。

        2 蛋白质组学研究方法新进展

        2.1 双向电泳技术

       是蛋白质组学研究中分离蛋白质样品的关键技术，能够在一块凝胶上分离出上万个蛋白质且所得蛋白质组分纯度＞90%。包括三步进行：一向等电聚焦电泳、平衡、二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。第一相使用固相pH梯度等电聚焦电泳（IEF），对样品中复杂的蛋白质进行整体性的分离，是目前应用最广泛的双向电泳技术，其特点是：pH梯度稳定、上样量大、无阴极漂移。第二相是SDSPAGE，根据需求不同可选择超薄水平凝胶电泳和垂直平板凝胶电泳。蛋白质分子量及携带的电荷是其重要性质，这两个性质并不相关，双向电泳（twodimensional gelelectrophoresis,2-DE）可利用蛋白质间性质差异对其进行分离，特点是：具有强大的分离能力，但并非所有蛋白点所包含的蛋白量都能在二维凝胶电泳图谱上进行蛋白鉴定，且该项技术费时、费力，不易实现自动化。因此，一批新的蛋白质分离技术涌现出来，差异凝胶电泳（Differential in-gel electrophoresis，DIGE）就是其中之一，其特点是：灵敏度高，能够精确定量和分析正常和病变细胞之间蛋白质变化，能够较好的比较两组样品差异；动态范围宽、且具有良好的重复性；能够减少科研成本支出，降低工作人员劳动量。高效液相色谱方法(HPLC)、毛细管区带电泳、毛细管等电聚焦、反相高效液相色谱等方法也可以进蛋白质分离，甚至可分离出亚蛋白质组，填补了双向电泳的不足。

        2.2 质谱技术

        与多维分离技术一同被视为蛋白质组学的核心技术，这些技术被用于分析蛋白质丰度和剖析表达水平，随着蛋白质组学技术的进步，蛋白质检测方法越来越多的应用于耳科，包括量化技术、蛋白质微阵列芯片和纳米蛋白质组学。由于2-DE技术在特殊蛋白、低丰度蛋白分辨率与重复性方面仍有一定的局限性，因此基于色谱技术的液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术成为蛋白质组学研究中的重要补充，常常将两种技术联用，以达到更好的检测效果。基质辅助激光解吸/电离-飞行时间-质谱技术（Matrixassisted laserdesorption/ionization，time-offlight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）作为目前蛋白质组学技术中比较理想的分析检测手段，常常应用于临床微生物检测和鉴定、新生儿耳聋易感基因及噪声性听力损失易感者血清蛋白指纹图谱的筛查。表面加强激光解吸电离-飞行时间-质谱技术（Surface enhanced laserdesorption/ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）是近年发展起来的针对蛋白质组学检测和研究的新技术，对样品的需求量和要求较低，对缓冲剂、高浓度盐和非挥发性成分具有一定耐受性，无需进行液相、气相色谱预先纯化，适用于分析2D-PAGE无法的分析蛋白质（低分子量、疏水性及PI值过高、过低的蛋白质）。具有自动化、高效率、更灵敏等优点，应用于临床诊断和治疗、院内感染细菌学检测及筛选疾病相关生物标志物。

         2.3 同位素相对标记与绝对定量技术（isobaric tags for relativeand absolute quantitation,iTRAQ）是美国应用生物系统公司(ABI)于2004年研发的蛋白定量技术。该技术将质谱图进行简化，使得不同同位素试剂标记相同多肽后，第一级质谱检测时的相对分子质量完全相同，同时提高了离子的检测丰度；低分子量区是质谱定性和定量较为准确的区域，该技术报告相对于相对分子质量（113-121）较低的离子，因此检测结果灵敏可靠；除细胞、组织外，还可采用血清/血浆、脑脊液、唾液、鼻分泌物和泪液等作为标本，可检测到胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白、线粒体蛋白等多种蛋白，同时进行2～8个样本的标记，操作过程简单，标记效率＞97%。具有分离能力强、标本来源范围广、结果可靠、灵敏度高、检测需求低、分析速度快、自动化等优势。

        2.4 蛋白组学在听觉系统中的研究进展

        Corti器是基底膜上由毛细胞和支持细胞组成的耳蜗听觉感受器。1980年，Thalmann等人运用双向电泳在Corti器中发现了两个特有蛋白质，在哺乳动物内耳及其他组织中均检测不到这类低分子量酸性蛋白，因此将其命名为Corti器蛋白Ⅰ（OCP-Ⅰ）和Corti器蛋白Ⅱ（OCP-Ⅱ）。Yoho等学者提出，OCP-Ⅰ与位于支持细胞、尤其是上皮细胞间隙连接系统细胞中的OCP-Ⅱ形成了调节、控制耳蜗间隙连接系统的复合体系，有助于去除有毒物质，拮抗异常电化学环境引发的生物障碍。澳大利亚学者Justin Tan的研究显示，神经营养因子受体-p75NTR在Corti器损坏创伤时，其表达显著增加，且对噪声损伤的听觉系统具有保护作用。

         3 蛋白质组学应用于耳科疾病变化研究

         3.1 噪声性耳聋

         噪声损伤导致感音神经性听力损失，是一个复杂的耳蜗病变过程。虽然前期已经进行了多个应激途径的研究，但是综合分析耳蜗噪声损伤反应的研究仍然缺乏。廖华发现，强脉冲噪声暴露可导致大鼠听皮层中的多种蛋白质表达的变化，这些差异蛋白可能参与强噪声听力损伤的修复过程以及听觉中枢的可塑性变化及功能重组。同时，研究发现，噪声可以诱导内耳感觉上皮细胞p38 MAPK信号通路蛋白表达的变化。Minal Patel采用定时定量PCR技术证实多补体基因在Corti器官表达，蛋白质表达分析揭示补体因子-1、补体成分-1、S组（C1s）表达水平在噪声创伤后出现强阳性表达，表明补充成分参与耳蜗听觉

损伤。

        3.2 药物性耳聋

        蛋白质组学研究也在药物性聋机制的研究中应用。日本学者Maeda将24mg/ml的地塞米松注入小鼠耳蜗内，12小时后，通过同位素相对标记与绝对定量技术-iTRAQ法，分析地塞米松在小鼠耳蜗蛋白质的差异性调节，结果显示地塞米松显著调制小鼠耳蜗蛋白的表达水平，与P0蛋白和HSP70蛋白与感音神经性听力损失密切相关。华盛顿大学Allison研究显示，Bax、Bcl-2、p53差异性调节新霉素和庆大霉素诱导的斑马鱼侧线毛细胞死亡，其中Bax抑制新霉素导致的毛细胞凋亡，Bcl2表达抑制庆大霉素诱导的毛细胞死亡，p53抑制新霉素和庆大霉素损伤，保护毛细胞，这表明促凋亡和促存活蛋白在治疗毛细胞药物的复杂的相互作用。孙建华发现，耳蜗毛细胞Cav1.3蛋白在氨基糖苷类药物毒性环境增加的趋势表明，发带状突触Cav1.3蛋白对药物毒性代偿作用，但由于药物的毒性效应的增加，这种代偿功能可能使听力下降，是听力损伤的机制之一。

         3.3 遗传性耳聋

         有学者对生后30天的野生型和患Usher综合征型小鼠耳蜗蛋白，在统一时间点进行耳蜗病理进行分析，通过2-DE和质谱分析技术-MS技术分析了2270点，69个点表现出明显变化，cochlin蛋白确定20肽点，其中大部分上调，只有少数下调，说明cochlin水平增加是导致u s h 1 f耳蜗神经退化重要的致病因素。Erwin等学者研究显示，vlgr1b、USH2A和whirlin共定位于连接纤毛和感光细胞、内耳螺旋神经节神经元的外界膜。Whirlin与动态Usher蛋白质相互作用，在视网膜和内耳具有多效性。

        3.4 老年性耳聋

       老年性耳聋是由于细胞凋亡导致的退行性疾病。王永生等学者对老年和青年大鼠耳蜗螺旋神经节Caspase-3的表达进行比较，发现老年大鼠ABR反应阈值较青年大鼠高，说明Caspase-3在老年大鼠耳蜗螺旋神经节中的表达增强，可能参与了大鼠耳蜗螺旋神经节细胞的凋亡。彭斌等发现3月龄大鼠的蜗核和听皮层蛋白质与18月龄大鼠存在差异，经肽质指纹图谱分析初步鉴定醛缩酶C、内质网蛋白29、亮氨酸氨基肽酶、谷氨酸脱氢酶等13个蛋白质可能与老年性耳聋相关。另外，已证实D-半乳糖诱导的小鼠细胞凋亡加剧，因此高脂肪饮食等外在因素可加速内耳中Caspase-3的表达。

         3.5 其他前庭听力损害

         哺乳动物前庭上皮细胞再生能力有限，Fukasawa等采用2D-DIGE比较前庭绒球蛋白代偿急性（48h）和慢性阶段（1w）间的差别，发现99个点的表现变化显著增强，急性期有45点单侧改变，慢性期有46点单侧改变。利用MALDI-TOF质谱分析技术，从12个蛋白点中确定了10种蛋白质，并发现在参与突触传递、神经纤维的形成和囊泡运输中的3个蛋白在急性期表达时才会发生改变。

        3.6 肿瘤相关性耳聋

        Mo hammad等学者采集前庭神经鞘瘤患者的脑脊液与正常脑脊液相比较。经过蛋白水解和iTRAQ标记后，使用蛋白串联质谱法来鉴定，检测到237种候选蛋白，在6个前庭神经鞘瘤患者的脑脊液标本中的3个标本中发现13种蛋白失调（12个上调，1个下调），至少在1个庭神经鞘瘤患者的脑脊液标本中发现4个有意义的外淋巴液蛋白失调。Dilwali发现前庭神经鞘瘤听力的好坏与高水平的成纤维细胞生长因子-2相关性较大，与肿瘤大小无关。同时有研究显示，最初在淋巴瘤细胞中发现的ILDR1缺乏可导致耳蜗外毛细胞变性和Corti器结构的破坏。

        3.7 中耳炎

        Klenke采用人类全基因组芯片研究胆脂瘤与正常外耳道皮肤细胞19596个基因表达的差异，确定了胆脂瘤性中耳炎上调mRNA，如MMP9，defb2和KRT19，胆脂瘤性中耳炎中3558个新的相关基因的转录，811个基因出现明显差异上调，334个基因表达下调超过2倍，以及蛋白质代谢活性显著调节基因包括基质金属蛋白酶、PI3、SERPINB3和SERPINB4。证实胆脂瘤的表达谱类似于转移性肿瘤、慢性炎症组织，提出胆脂瘤调节转录的蛋白质-蛋白质相互作用和信号转导网络，给药物靶向治疗发展提供了理论依据。

         4 展望

        包含重力、角加速度、听觉三大感受系统的内耳，是哺乳动物最复杂的器官之一，在部分蛋白质翻译修饰后性状发生改变，而引起继发性效应，出现听觉生理或病理性下降，甚至导致耳聋。对于耳聋蛋白质组学的重点研究，可以帮助学者们深入认识内耳基因表达。蛋白质组学技术的发展，对于促进寻找差异蛋白、探讨生物学过程以及研究疾病机制、药物作用机制起到积极作用。蛋白质组学作为一种高通量筛选性研究技术，仍需要免疫组化、免疫印迹等技术配合进行蛋白质定量，同时结合RNA干扰、药理学等实验研究蛋白功能弥补单纯蛋白质组学的局限性。进一步增加蛋白质组学在听觉发育、听觉相关疾病，特别是在听觉系统生理、病理机制方面中的研究应用，有望为临床听觉系统相关疾病诊治、药物研发提供新途径。