研究蛋白-配体相互作用的NMR机时(6)

（5）WaterLOGSY

WaterLOGSY实验技术全称为water-ligand observed via gradient spectroscopy，它是基于这样一个发现：在蛋白-配体复合物的X-射线晶体结构中，蛋白质内部空穴部位和蛋白-配体结合部位往往存在着一些束缚态水分子，其与蛋白之间存在着NOE及氢键，且其驻留时间较长，蛋白与配体是通过水分子发生结合作用的。基于这个发现，Claudio等人开发出了WaterLOGSY实验技术（J Biomol NMR 2000,18:65-68, J Biomol NMR 2001,21:349-359,），与STD不同的是WaterLOGSY方法选择性饱和的是水分子而不是蛋白上的质子。

由于大量的水分子通过各种与蛋白的相互作用停留在蛋白表面，所以当我们选择性饱和照射水分子时，饱和会转移到蛋白上，再经自旋扩散，饱和进一步转移到整个配体－蛋白复合物；通过结合态和游离态配体的化学交换，饱和转移到自由态配体。由于自由态配体的NOE 信号往往为小的正值，而束缚态配体的NOE 信号往往为大的负值，当选择性地激发水信号，对能与蛋白质结合的配体而言，水磁化转移途径为体水（自由水）→蛋白质－配体复合物→自由态配体，这时配体对应较大的负NOE 信号；而对不与蛋白质结合的配体而言，水磁化转移途径为体水→自由态配体, 这时配体对应小的正NOE 信号，即能与蛋白质结合的配体NMR 信号与不能结合的配体NMR 信号符号相反，从而得以筛选出能与蛋白质发生相互作用的配体。

实际工作中，样品中配体的浓度远远高于蛋白的浓度，一般是蛋白浓度的几十倍之多，而图谱处理时，往往把能与蛋白质结合的配体的NMR信号定义为正信号，而不能与蛋白质结合的配体NMR信号就呈现为负信号了。在文献（J Biomol NMR 2000,18:65-68）中，作者利用WaterLOGSY实验技术鉴定能与蛋白质结合的配体，见Fig1，上图为参考谱，下图为WaterLOGSY谱，在WaterLOGSY中，正峰表示这个配体与蛋白有结合，在参考谱中以“*”表示，而与蛋白没有结合的配体，在WaterLOGSY中为负峰。

Fig1.(Top) reference spectrumand (bottom) WaterLOGSY spectra for a mixture of compounds in the presence of10 mMcyclin-dependent kinase 2 (cdk2). The positive signals in theWaterLOGSYspectrum identifies binding of cdk2 ligand ethylalpha-(ethoxycarbonyl)-3-indoleacrylate, of which the resonances are indicatedwith an asterisk in the reference spectrum. （J Biomol NMR 2000,18:65-68）

WaterLOGSY实验中的极化转移途径可以通过分子间NOE和化学交换实现。分子间NOE发生在结合水·蛋白·结合态配体这个复合体上，而化学交换是蛋白分子的活泼质子（如-OH、-NH上），与水的交换。因极化转移途径的差别，WaterLOGSY实验所检测的信号与STD存在区别，在WaterLOGSY实验中，没有结合的小分子信号也可能得到观测。

WaterLOGSY通过对水的磁化矢量的选择性激发，进而依靠水、蛋白、配体三者之间的化学交换和NOE效应将水的磁化矢量传递到配体小分子，实现与生物大分子有相互作用的配体小分子的快速选择性检测。但是，该实验设置复杂，水的磁化矢量选择性激发需要准确的优化，技巧性较高，造成该实验普适性较低。WaterLOGSY实验适用于检测与靶标大分子弱结合的配体小分子，可以检测的K_D值在10^‑10至10^-2之间。