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实验室里，我们常听到，“你的flag砸（杂）出来了么？”
“头大啊~没有呢，我打算换个tag试试。”
重组蛋白表达技术现已在生物学各个具体领域应用广泛，尤其是蛋白质的大规模生产和体内功能研究都需要应用重组蛋白表达载体。
而蛋白标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。下面中洪君将为你讲解各种不同功能的蛋白标签及其优缺点，便于助大家选择。
蛋白纯化标签比较
一. 常用的蛋白标签有哪些？
HIS标签
His标签是当前最为热门的标签蛋白之一。His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合配体）利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析（IMAC），对重组蛋白进行分离纯化。
Flag-tag
Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK），同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。
AviTag
是一个15个氨基酸的短肽，具有一个单生物素化赖氨酸位点，与已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目标蛋白的N端和C端。融合表达后，可被生物素连接酶生物素化，为了纯化重组蛋白选用低亲和性的单体抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白质分离纯化，还用于蛋白质相互作用研究。
SNAP-Tag
SNAP-Tag是从人的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移（O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase）获得。SNAP所带的活性巯基位点接受了苯甲基鸟嘌呤所携带的侧链苯甲基基团，释放出了鸟嘌呤。这种新的硫醚键共价结合使SNAP所带的目的蛋白携带上了苯甲基基团所带的标记物。
检测：生物素或各种颜色荧光的底物（如荧光素、若丹明）可渗透进入细胞，方便快捷地进行活细胞内SNAP-Tag融合蛋白的标记与检测。它们也可特异性地标记大肠杆菌，酵母和哺乳动物等细胞抽提液或已经纯化的蛋白液中的SNAP-tag融合蛋白。
将纯化的或未纯化的SNAP-Tag融合蛋白与表面固定了苯甲基鸟嘌呤的基质混合，蛋白即可特异与底物作用，形成共价键，融合蛋白间接被固定在了基质表面上，可以达到更方便快捷地研究蛋白功能或纯化蛋白的目的。
GST（谷胱甘肽巯基转移酶）
GST标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它的天然大小为26KD。GST融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表达，可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。结合的融合蛋白在非变性条件下用10mM还原型谷胱甘肽洗脱。GST标签可用酶学分析或免疫分析很方便的检测。标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性。
纯化：该表达系统表达的GST标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和树脂进行纯化。
如果要去除GST融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。
检测：可用GST抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。
GFP
GFP（绿色萤光蛋白）是由下村修等人在水母中发现的。它在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。GFP标签可位于蛋白质的C端或N端，该系统已广泛应用于各种细胞类型，包括细菌、酵母和哺乳动物细胞等，相应的GFP标签抗体也被广泛应用。GFP在检测蛋白表达、蛋白和细胞荧光示踪、研究蛋白质之间相互作用和构象变化中，起到了重要的作用。
常规化的c-Myc
C-Myc标签蛋白，是一个含11个氨基酸的小标签，它作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中可识别其相应抗体。C-Myc tag已成功应用在Western-blot杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中，可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。
荧光素酶（luciferase）:
来源于生物体内的荧光素，常见的有萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶和Guassia荧光素酶。这些荧光素酶作为“报告蛋白”被用于分子生物学研究中，这种技术被称为报告基因检测法或萤光素酶检测法（Luciferase Assay）。跟普通融合蛋白标签不同，使用荧光素酶构建的报告基因可用作目的基因的定量分析。因此常用于研究启动子、miRNA 3'UTR克隆的功能与调控，因为它们对目的基因的调控可以是渐变的，而不是简单的开和关两种状态。
二、常用蛋白标签优缺点对比
标签 | 主要应用 | 优缺点 |
| HIS | His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究 | 1.标签的分子量小 2.可在非离子型表面活性剂存在/变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用； 5.可应用于多种表达系统，纯化的条件温和； 6.可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 7、免疫原性相对较低； |
| Flag-tag | 广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域，在真核表达系统中表达效率更高。 | 1.其通常不会与目的蛋白相互作用，便于研究人员对融合蛋白进行下游研究。 2.其目的蛋白，可直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 3.其可以被抗FLAG的抗体识别，便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。 4.融合在N端的FLAG，其可以被肠激酶切除（DDDK），从而得到特异的目的蛋白。 |
| AviTag | 除了用于蛋白质分离纯化，还用于蛋白质相互作用研究。 | 1.无论在体外或者体内，几乎所有的蛋白都可以在一个独特的Avi Tag位点轻易且有效地被生物素化； 2.生物素化是通过酶和底物的反应来实现，反应条件相当温和而且标记的专一性极高； 3.生物素AviTag只有15个氨基酸，对蛋白空间结构的影响非常小。 |
| SNAP-Tag | 1、不仅专一性极高而且稳定；适用于多种环境下的蛋白质检测与纯化，如活细胞内、溶液中、或固态相(如SDS-PAGE gels)等。 3、无论体内还是体外，SNAP标签反应是高特异的。 | |
| GST | GST融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表达，可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。 | 1、它是一个高度可溶的蛋白； 2、它可在大肠杆菌中大量表达，起到提高表达量的作用。 3、在大多数情况下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，并形成二体。GST标签可用酶学分析或免疫分析很方便的检测。标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性。在大多数情况下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。 |
| c-Myc | 应用在 Western-blot杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中, 可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。 | 含11个氨基酸作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中仍可识别其相应抗体。 |
| 荧光素酶 | 常用于研究启动子、miRNA 3'UTR克隆的功能与调控 | 1.灵敏度高，检测幅度宽； 2.不是哺乳动物细胞内源性基因； 3.重复性好； 4.与HTS兼容等。 |
三、 该如何选择表达克隆的标签
1、首先，需要确定融合标签的目的
蛋白纯化 ：标签的普遍用途是蛋白纯化。小分子6XHis Tag常被用于细胞内源蛋白的纯化。6XHis Tag也广泛应用于大肠杆菌的蛋白纯化。可是哺乳动物细胞中因非分泌蛋白自身存在高组氨酸背景，因此极少使用6XHis Tag。
Western Blot检测：若需要做Western Blot实验来检测细胞裂解物中蛋白的表达，你可以选择有匹配的抗体的小分子标签。FLAG® Tag以其分子量小以及拥有许多与之匹配的商业化的抗体等优势，成为Western Blot实验中常用的Tag。
免疫沉淀反应：FLAG® Tag其分子量小以及拥有大量相匹配的商业用抗体等优势成为免疫沉淀反应中最常用的Tag. 其他常用的标签有：HA和cMyc.
活细胞成像：荧光蛋白（Fluorescent Proteins, FPs）是活细胞成像常用的标记蛋白。其中最常用的是绿色荧光蛋白（GFP）和它的衍生物（CFP, YFP, etc.），以及一些红色变体，如dTomato和mCherry.
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2、考虑融合标签的影响
任何一类标签处于氨基酸序列的任一位置，都具有影响目的蛋白表达或功能的可能性。最主要原因是标签可能会干扰蛋白的正确折叠，致使目的蛋白失活或形成包涵体。其次，标签可能会中断亚细胞定位信号，这种情况下，蛋白能够正确翻译和折叠，但在细胞内所处的位置是错误的。因此，您需要知道添加的标签对目的蛋白的表达是否有影响。
3、考虑是在N-端还是C-端标记
N-端或C-端标记的选择还需要根据蛋白结构、定位等特性。然而，倘若你没有确切的蛋白结构，或蛋白功能域图谱，建议分别构建N-端标记和C-端标记的表达克隆，以检测哪个更有效。
在表达克隆中添加融合标签，我们可以通过哪些方式减少融合标签的潜在负面影响？可在文末留言与我们交流！
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博元君有话说
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