干货:SDS-PAGE操作视频/经验问答/操作SOP

2023-05-10 14:56:27

导语

想知道怎么做电泳吗?今天小编就为大家分享SDA-PAGE凝胶电泳的实验技巧、经验问答、操作流程,下面跟随小编一起进入电泳的时间吧,如果觉得不错,看完记得Mark和分享哦~





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SDS-Page电泳问答


SDS-Page电泳主要利用聚丙烯酰胺的分子筛效应分离蛋白质和核酸,SDS-PAG蛋白质电泳分析可从蛋白质亚基分子量的大小就分离蛋白质。

几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行,而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集,最常用的就是SDS-PAGE电泳技术,关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论:


Q:SDS-PAGE电泳的基本原理?

A:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基硫酸钠),SDS会与变性的多肽,并使蛋白带负电荷,由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关,因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关,在达到饱和的状态下,每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW为分子量,X为迁移率,k、b均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。


Q:配胶缓冲液系统对电泳的影响?

A:在SDS-page不连续电泳中,制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统,浓缩胶是pH6.7,分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中,其pH环境呈弱酸性,因此甘氨酸解离很少,其在电场的作用下,泳动效率低;而CL离子却很高,两者之间形成导电性较低的区带,蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比,这一区带便形成了较高的电压剃度,压着蛋白质分子聚集到一起,浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后,由于胶中pH的增加,呈碱性,甘氨酸大量解离,泳动速率增加,直接紧随氯离子之后,同时由于分离胶孔径的缩小,在电场的作用下,蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。

所以,pH对整个反应体系的影响是至关重要的,实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况,应首要考虑该因素。


Q:样品如何处理?

A:根据样品分离目的不同,主要有三种处理方法:还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。

1、还原SDS处理:在上样buffer中加入SDS和DTT(或Beta巯基乙醇)后,蛋白质构象被解离,电荷被中和,形成SDS与蛋白相结合的分子,在电泳中,只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理,样品稀释适当浓度,加入上样Buffer,离心,沸水煮5min,再离心加样。

2、带有烷基化作用的还原SDS处理:碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团,得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT,而防止银染时的纹理现象。100μl样品缓冲液中10μl 20%的碘乙酸胺,并在室温保温30min。

3、非还原SDS处理:生理体液、血清、尿素等样品,一般只用1%SDS沸水中煮3min,未加还原剂,因而蛋白折叠未被破坏,不可作为测定分子量来使用。


Q:SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用?

A:聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关;

制胶缓冲液:浓缩胶选择pH6.7,分离胶选择pH8.9,选择tris-HCL系统,具体作用后面介绍;

TEMED与AP:促凝作用,加速聚丙烯酰胺的凝固;

十二烷基硫酸钠(SDS):阳离子去污剂,作用有四:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。


Q:提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径?

A:1、聚丙烯酰胺的充分聚合,可提高凝胶的分辨率。建议做法:待凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天,SDS可水解聚丙烯酰胺。

2、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料,不同染料又各自不同的染色方法,具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。


Q:“微笑”(两边翘起中间凹下)形带原因?

A:主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致,多出现于较厚的凝胶中。

处理办法:待其充分凝固再作后续实验。


Q:“皱眉”(两边向下中间鼓起)形带原因?

A:主要出现在蛋白质垂直电泳槽中,一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。

处理办法:可在两板间加入适量缓冲液,以排除气泡。


Q:为什么带出现拖尾现象?

A:主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

处理办法:加样前离心;选择适当的样品缓冲液,加适量样品促溶剂;电泳缓冲液时间过长,重新配制;降低凝胶浓度。


Q:为什么带出现纹理现象?

A:主要是样品不溶性颗粒引起的。

处理办法:加样前离心;加适量样品促溶剂。


Q:什么是“鬼带”,如何处理?

A:“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时,常会出现在泳道顶端(有时在浓缩胶中)的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀,主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性,致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合,聚合成大分子,其分子量要比目标条带大,有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性,在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。

处理办法:在加热煮沸后,再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇,以补充不足的还原剂;或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。


Q:为什么溴酚蓝不能起到指示作用?

A:我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底,但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。

处理办法:更换正确pH值的Buffer;降低分离胶的浓度。


Q:为什么电泳的条带很粗?

A:电泳中条带很粗是常见的事,主要是未浓缩好的原因。

处理办法:适当增加浓缩胶的长度;保证浓缩胶贮液的pH正确(6.7);适当降低电压;


Q:为什么电泳电压很高而电流却很低呢?

A:这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上,可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配,电流未形成通路。包括:a.内外槽装反;b.外槽液过少;c.电泳槽底部的绝缘体未去掉(比如倒胶用的橡胶皮)。

处理办法:电泳槽正确装配即可。


Q:浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗?

A:这主要出现在初学者中,一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致;后者是由于在解除制胶的夹子后,板未压紧而致空气进入引起的。

SDS-PAGE电泳技术流程    
技术原理

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基硫酸钠), SDS会与变性的多肽,并使蛋白带负电荷,由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关,因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关,在达到饱和的状态下,每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW为分子量,X为迁移率,k、b均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

实验用品(溶液配制说明详见文章下方)

蛋白样品,SDS-PAGE loading buffer,PBS,Tris-Hcl (PH 8.8), Tris-Hcl (PH 6.8) ,30%丙烯酰胺,10%SDS,10%过硫酸,5×SDS-PAGE电泳缓冲液,考马斯亮蓝R-250染色液,脱色液。

实验步骤

一、凝胶配置


1.分离胶的配制

(1)找出配套的胶板,用擦镜纸擦干净,并固定在配胶器上。随后用去离子水试漏;

(2)若胶板不漏水,就进行分离胶的配制。依次将水、30%丙烯酰胺、1.5M Tris-Hcl(PH 8.8)、10%SDS、10%过硫酸铵加到干净的小烧杯中,混匀(1mm的胶板,一般配一块胶用5ml。所配的胶浓度一般为12%,但浓度也要视情况而定。蛋白越小,胶的浓度越大);

(3)将胶板中的水倒掉,并用滤纸吸干水分(不要将滤纸塞到胶板底部);

(4)小烧杯中再加入TEMED,混匀。(TEMED可使胶凝固,所以最后加);

(5)灌胶:混匀的分离胶沿着胶板边缘轻轻灌下,防止产生气泡;

(6)用水将分离胶压平(用水灌满,同时加水时要缓慢加入,防止把胶吹起)。


2.浓缩胶的配制

(1)待分离胶与水中间形成明显的横线,即分离胶凝固。随后进行浓缩胶的配制,依次将水、30%丙烯酰胺、1.0M Tris-Hcl(PH 6.8)、10%SDS、10%过硫酸铵加到干净的小烧杯中;

(2)将分离胶上层的水倒掉,并用滤纸吸干水分(尽量不要把滤纸插入);

(3)小烧杯中再加入TEMED,混匀;

(4)灌胶。然后插入梳子;

(5)把制胶器倒过来,胶仍然不会往外流,或可以明显看出梳子中两个齿之间的胶面明显凹下去,说明浓缩胶凝固。将凝固的胶板装入电泳槽内,并在电泳槽内加入SDS-PAGE电泳缓冲液,把胶浸泡一段时间,时间越长越好(防止梳子与胶相连,或胶因湿度不够而萎缩);

(6)点样时,再把梳子拔出来,拔时动作要轻,防止胶齿被拔断。


二、SDS-PAGE电泳


1、调胶:拔掉SDS胶上的梳子,并用小针调整齿的位置(使它们都平行)。

2、点样:用20µL的小枪头,吸煮过的样品10µL,对准胶孔点样,注意不要把样品点在外面。使用适当的分子量蛋白marker。

3、电泳:电泳仪正负极接好,打开电源。浓缩胶:电压 low 100V

分离胶:电压 high 150V。

4、卸胶:等胶内的所有的蓝色都跑出去,电泳停止,一般时间为1-2小时左右。把胶板从电泳仪上卸下,用刀片把胶板撬开,胶的浓缩胶部分割除;

5、染色:放入考马斯亮蓝R-250染色液中进行常温过夜染色;

5、脱色:将过夜染色的SDS-PAGE胶放入脱色液中进行脱色,直到背景发白。


 
相关试剂配置说明
    


一、3×SDS-PAGE loading buffer的配制


3×SDS-PAGE loading buffer

10ml 

1M Tris-Hcl (PH 6.8)

1.5ml

SDS

0.6g

BPB(溴酚蓝)

30mg

甘油(丙三醇)

3ml

去离子水

5.5ml

1、将除BPB以外的药品完全溶解。SDS常温下很难溶解,可以在37℃水浴溶解。完全溶解后,再加入BPB,进行溶解;

2、把溶好的buffer分装到1.5ml的离心管中,1ml/管,常温放置;

3、使用前,每管加入30µL巯基乙醇。


注意事项:巯基乙醇为危险品,加入的过程在通风橱中完成,并且带好手套。


二、10×PBS的配制


0.1M PBS(10×PBS)

1L

NaH2PO4.2H2O

2.83g

Nacl

85g

Na2HPO4.12H2O

28.98g

1、用去离子水将以上药品进行溶解;(溶解的非常慢,可能需要过夜)

2、调PH值到7.2,用0.4µm的滤膜过滤。常温保存;

3、工作时用的是1×PBS。


三、1.5M Tris-Hcl (PH 8.8) 的配制


1.5M Tris-Hcl

250ml

Tris

45.425g

1、用200ml去离子水将Tris溶解。

2、用浓盐酸调PH值到8.8。

3、调好PH的Tris-Hcl定容到250ml。

4、0.4µm的滤膜过滤,常温保存。


注意事项:Tris的缓冲能力很强,调PH值时,费些时间,但不要调过。


四、1M Tris-Hcl (PH 6.8) 的配制


1M Tris-Hcl

250ml

Tris

30.275g

1、用200ml去离子水将Tris溶解;

2、用浓盐酸调PH值到6.8;

3、调好PH的Tris-Hcl定容到250ml;

4、0.4µm的滤膜过滤,常温保存。


五、30%丙烯酰胺的配制


30%丙烯酰胺

250ml

丙烯酰胺

72.5 ml

BIS甲叉丙烯酰胺

2.5 ml

1、把药品用去离子水溶解后定容到250ml;

2、用滤纸过滤,放在棕色瓶子中,4℃保存。


注意事项:两种药品有毒性,配制过程要带手套和口罩。


六、10%SDS的配制

1.1g  SDS加入10ml去离子水进行溶解;

2.分装到1.5ml离心管中,-20℃保存。


七、10%过硫酸铵的配制

1.1g 过硫酸铵加入10ml去离子水进行溶解。

2.分装到1.5ml离心管中,-20℃保存。


八、5×SDS-PAGE电泳缓冲液的配制


5×SDS-PAGE电泳缓冲液

1L

Tris

15.1g

Glycine(甘氨酸)

94g

SDS

5g

将以上药品用去离子水溶解后定容到1L,常温保存。工作时用的是1×SDS-PAGE电泳缓冲液。


九、考马斯亮蓝R-250染色液的配制

1、往1g考马斯亮蓝R-250中加入250ml异丙醇,在磁力搅拌器上搅拌六小时以上;

2、加入650ml去离子水,磁力搅拌器搅拌过夜;

3、再加入100ml冰醋酸进行溶解,磁力搅拌器搅拌;

4、在通风橱内用滤纸进行过滤。常温保存。染色液只能反复用两次。


注意事项:在磁力搅拌器上搅拌时,要把容器封口。


十、脱色液的配制


脱色液

1L

醋酸(冰乙酸)

100ml

乙醇(无水乙醇)

50ml

去离子水

850ml

常温保存。


来源:药时空

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