Western Blot (蛋白质免疫印迹)及其相对定量分析

 一、基本原理

蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。蛋白免疫印迹（Western Blot）是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

二、实验步骤

蛋白样品制备

（1）配制1×蛋白裂解液：100 μL 6×蛋白裂解液，488 μL ddH₂O，12 μL PMSF；（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）

（2）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 
1、 吸弃培养液，尽量吸除干净。 
2、 6孔板中每孔细胞加入1ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。洗涤细胞，然后弃去洗液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 
3、 6孔板中每孔细胞加入150 µL的细胞裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养皿要经常来回摇动。 
4、 裂解完后，用干净的细胞刮刀将细胞刮于培养皿的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） 

5、煮沸变性12min。

6 用200 µL考马斯亮蓝G-250+4 µL蛋白裂解液定量后，放于-80 ℃保存使用。

SDS－PAGE电泳

原理：

    聚丙烯酰胺（acrylamide）和双丙烯酰胺（Methylenediacrylamide）聚合，此过程是由四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸铵（AP）激发的。被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机接上双丙烯酰胺，是多聚链交联成立体网状结构，最终多聚链聚合成凝胶状。

    SDS即十二烷基硫酸钠,是阴离子表面活性剂,它能以一定的比例和蛋白质结合,形成一种SDS-蛋白质复合物。
    SDS—PAGE分离蛋白的主要原理,是各种物质分子量的差异性。因为当SDS与蛋白质结合后,蛋白质分子即带有大量的负电荷,并远远超过了其原来的电荷,从而使天然蛋白质分子问的电荷差别就降低乃至消除了.与此同时蛋白质在SDS作用下结构变得松散,形状趋向一致,所以各种SDS一蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异,就反映了分子量的差异。

（1）清洗玻璃板： 
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后晾干。 
（2） 灌胶与上样 

1、 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。） 
2、 按前面方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用1ml枪吸取1ml胶沿玻璃灌注，灌注量保持在6-6.5ml。灌注后胶上加0.5ml 有机溶剂，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。液封时要很慢，否则胶出现变形。） 
3、 封液和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。 
4、 按前面方法配4%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。 
5、 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。） 
6、 取8 μL的loading buffer再加入40 μL的蛋白样混匀，100 ℃沸水煮10 min。
7、 加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样枪头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。）
（3） 电泳 

先用70 V电压，当观察到溴酚蓝位于浓缩胶和分离胶交界处，同时看到蛋白Marker分离及溴酚蓝下方出现一条淡粉色浅带时将电压调至120 V，直至溴酚蓝跑到胶的最底端。

转膜

（1） 转一张膜需准备8张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的NC膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。NC膜剪的大一些，防止短路。

（2） 在加有半干转液的盘里放入NC膜、滤纸。  
（3）转膜：转膜装置从上至下依次顺序为：按阳极碳板、3层滤纸、NC膜、凝胶、3层滤纸、阴极碳板。将滤纸、凝胶、NC膜对齐，每一步去除气泡，将碳板上多余的液体吸干。电转移过程在恒定电流下进行，电流大小由膜面积决定，约为1-1.5 mA/cm²，电转移时间由所检测目的蛋白大小决定，转移3 h，转移结束后，断开电源将膜取出；

免疫反应

（1）封闭：用PBS配置5％脱脂奶粉室温封闭1-2 h；

（2）封一抗：加入相应的一抗至孵育袋中，4 ℃过夜；

（3）回收一抗，用PBS缓冲液洗NC膜，共洗3次，每次5 min；

（4）封二抗：加入相对应的二抗，山羊抗兔或山羊抗鼠，平稳摇动，室温避光孵育2 h；

（5）回收二抗，用PBS缓冲液洗膜，共洗3次，每次洗5 min；

（6）利用Oddysey远红外成像系统扫膜。

 

Tips:

︶ 条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。
︵ 条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。
拖尾：样品溶解不好。
纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。
条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。
条带两边扩散：加样量过多。

结果分析

 

利用ImagJ对Western Blot条带进行灰度分析

1、File— open 打开WB片子

2、把图片转化成灰度图片image— type— 8-bit

3、消除背景影响
process——》subtract background 选择50基本可以

     

4、选择矩形选项

5、选中条带

  

6、选择所有泳道之后按下3，出现分析图谱

    

7 峰值计算

选择直线，从起峰处至落峰处封闭。点一下刚才的封闭区，峰值计算结果会出现在新的窗口中。