原来检测细胞增殖,方法这么多(上)

2023-05-10 14:56:27

导读

上期我们详细介绍了评价细胞增殖能力之克隆形成实验，但一经查阅文献，殊不知原来相关检测方法居然还有10余种，如MTT、MTS、CCK8、SRB及DNA合成检测和ATP浓度检测等等，那在这些方法中我们该作何选择，确实是个头大的难题。本期我们就一起看看究竟哪一种方法最适合你的？

细胞增殖检测实验的意义

细胞增殖是指细胞在周期调控的因子下，通过DNA复制等反应，完成细胞分裂的过程。增殖检测一般是分析分裂中的细胞数量的变化，进而反应细胞的生长状态及活性，目前广泛应用于肿瘤生物学，分子生物学，药代动力学等领域。

肿瘤细胞增殖和转化过程

细胞增殖检测实验的分类

细胞增殖检测实验根据实验方案和目的不同分为以下几种：

1. 细胞代谢活性检测通过检测活细胞相关的物质的含量（如蛋白质、酶）等间接地测定待活细胞的数量来评价细胞的增殖能力。

特点：间接的方法，反应的是细胞活性而非是否在增殖；
常见实验举例：MTT、XTT、MTS、CCK8法及SRB法；
应用：细胞活力、药物作用的毒性，适合高通量分析实验。

2. 细胞DNA合成检测通过测定细胞的DNA合成含量来评价细胞的增殖能力。

特点：直接测定DNA合成是检测细胞增殖最准确方法；
常见实验举例：BrdU和EdU；
应用：细胞DNA修复，分化及细胞标记物追踪等。

3. ATP浓度检测利用荧光素酶Luciferase反应细胞ATP的含量，进而反应细胞活性。

特点：结果灵敏；
常见实验举例：荧光素酶催化反应；
应用：高通量细胞增殖检测和筛选。

4. 细胞增殖相关抗原检测通过检测增殖细胞特异性地表达某些特定蛋白，如Ki-67，PCNA等常作为人体细胞增殖的标志。

特点：反应体内肿瘤细胞的增殖能力，但是需组织切片不适合高通量；
常见实验举例：细胞增殖的标志物的免疫组化等；
应用：体内肿瘤组织。

5. 染料排斥法活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、苯胺黑等的能力，而死细胞由于膜完整性的破坏，可被着色。适合少量细胞的统计，广泛用于绘制细胞生长曲线等。

以上方法我们一般是根据你的实验目的，细胞类型来决定最终的选择。

本期我们先为大家介绍了一下，第一大类：基于细胞代谢活性的检测：包括酶活如MTT、MTS、CCK8等；蛋白含量的SRB实验。又可统称为比色法，主要基于颜色的变化来反应细胞数量，十分适合高通量药物筛选，进而计算药物的IC50。

第一类：MTT、MTS、CCK8等

这一类的实验原理基本类似，细胞线粒体的脱氢酶可将MTT、MTS、CCK8等试剂还原为有色产物，可在酶标仪上于不同波长（490nm、490nm、450nm）处检测OD值，在一定范围内，吸光度值与活细胞数目成正比，进而反应细胞数量。

MTT是最早出现的检测方式，于1983年由Mosmann建立的方法，MTT为四唑盐，但是存在一定的缺陷，特别是还原产物不溶水，且对细胞有较大毒性，因此限制了其使用，目前基于MTT开发的MTS、CCK8等，应用更加广泛。

MTT对细胞的毒性：

A图为刚加入MTT（0.5mg/ml）NIH-3T3细胞形态，B图为加入MTT后4h，细胞形态发生了明显改变[1]。

如下为MTS的原理：MTS被乳酸脱氢酶还原为黄色的Formazan

1. MTS的操作步骤：

细胞接种到96孔板培养；
37℃培养箱培养几天；
培养完成后，每孔加入MTS和PMS（20:1比例）混合溶液后继续孵育2-3h，现在大部分公司提供的商品化MTS已处理好可以直接加入进行检测；
终止培养，使用酶标仪，在490nm处测定吸光度值；

注意：避光操作。为了保证实验结果有良好的线性，MTS实验中吸光度值应保持在0.75-1.25之间较好；肿瘤细胞一般要根据其生长速度及本身代谢情况进行铺板。

优点：

操作简单，比MTT高效，产生水溶性的Formazan，无需用DMSO溶解；
由于MTS被还原产物颜色较深，吸光度值变异范围大，使测定更加敏感准确；
快速，作用时间2-3小时为最佳，而MTT需4小时；
重复性好，还原产物稳定。

2. CCK8法的操作步骤：

细胞接种到96孔板培养；
培养完成后，每个孔中加入10μLCCK8试剂；
37℃培养箱中孵育1-4h；
使用酶标仪，在450nm处测定其吸光度值。

优点：

使用方便，检测快速；
灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；
对细胞毒性小；
产物水溶性，不需换液，尤其适用于悬浮细胞。

缺点：与MTT相比，CCK-8和MTS的价格贵。

注意：避光操作。

第二类：SRB比色法

SRB磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B)，一种粉红色阴离子染料，在酸性条件下可特异性地与细胞内碱性氨基酸结合；在540 nm波长下产生吸收峰，在一定范围内，吸光度值与活细胞数目成正比。

实验步骤：

从培养箱中取出培养好的待检测细胞量的96孔板样品；
每孔加入TCA（50%的三氯乙酸）固定细胞，4℃放置1h；
弃去固定液，蒸馏水洗5-6次，室温晾干或吹风机吹干；
每孔中加入SRB染液100μL，室温放置10-30min；
弃去染液，用1%醋酸洗涤，直至在白色纸上倒扣轻拍无明显染料颜色；
每孔加入150μLTris溶液；
用酶标仪在515nm处测定吸光度值；

注意：SRB实验结果中OD值在0.8-1.2之间时线性较好；肿瘤细胞一般要根据其生长速度及本身代谢情况进行铺板。

优点：不存在孵育时间限制，即细胞固定后以放置较长时间；与MTS,CCK8相比，检测时间可以自己掌握，不受限制，更适合大规模试验。

缺点：操作步骤繁琐，不适合悬浮细胞。

如下图，图A表示肺癌细胞系H441细胞数量与SRB染料对应的吸光度值成线性关系，B图显示SRB方法来测试miRNA对两株肺癌细胞细胞系的增殖影响[2]。

常见问题汇总

MTS、CCK8及SRB法等方法，如何确定选择哪个？

大家可根据实验要求和预算进行选择，价格方面，CCK8和MTS大于SRB，但是SRB操作较繁琐，但个人觉得SRB线性更好，但不适用于悬浮细胞。

OD不在线性范围内，怎么办？误差大吗？

如MTS要求0.8，（通常来说，比色法测定细胞增殖试剂盒中都会注明最佳反应时间，通常MTS/CCK8反应最佳时间为1h-4h，我们实验初期固定孵育时间如1h，通过比较不同细胞量的OD值来确定实验细胞铺板量，根据具体情况进行调整。

对细胞密度有要求吗？

不同类型的细胞，代谢活性不同，影响细胞代谢的因素也会影响细胞数和吸光值的关系。细胞在高细胞密度时会产生接触抑制，进而代谢活性降低，导致细胞数和吸光度值的非线性关系。对大多数肿瘤细胞，杂瘤细胞和纤维母细胞系，推荐5000cells/孔作为增殖研究的起始细胞数，虽然少于1000个细胞通常也可被检测。血淋巴细胞例外，一般需要25,000–250,000细胞/孔才能获得足够的吸光值。可以参考下图的实验来确定细胞数。

本期我们就为大家介绍到这这里了，主要讲述了比色法的几种常见实验，我们要根据自己实验目的和细胞类型来选择最合适自己的方法。下一期我们继续为大家介绍剩余的几种检测方法。

参考文献

1. Riss T L, Moravec R A, Niles A L, et al. Cell viability assays[J]. 2016.

2. Kasinski A L, Kelnar K, Stahlhut C, et al. A combinatorial microRNA therapeutics approach to suppressing non-small cell lung cancer[J]. Oncogene, 2015, 34(27): 3547-3555

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