蛋白质组学在肾脏疾病研究中的应用

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【摘要】研究肾脏疾病发病机制和生物标志物，有助于临床上提高诊断和治疗水平。蛋白质组学是研究发病机制及生物标志物的重要手段。本文对蛋白质组学的发展历史、主要技术方法以及蛋白质组学在IgA肾病、糖尿病肾病、膜性肾病、急性肾损伤和肾癌研究中的应用做了详尽的阐述，并对日后蛋白质组学在肾脏疾病研究中的应用做了展望。

【关键词】蛋白质组学；肾脏病；肾细胞癌；慢性肾脏病

 

蛋白质组学、转录组学和基因组学是二十一世纪生命科学中的三大组学，也是研究生命活动、疾病发病机制以及生物标志物的重要学科。在三大组学中，蛋白质组学发展历史最短、发展速度最快、技术手段也最丰富。肾脏疾病是人类常见的疾病，其中最常见的慢性肾小球疾病是导致肾功能衰竭的重要原因。研究肾脏疾病的发病机制将有助于治疗肾脏病，保护肾脏功能，提高患者生存质量。本文将重点介绍蛋白质组学在肾脏病的发病机制以及生物标志物研究的主要进展。

 

一、蛋白质组学简介

“蛋白质组”（proteome）来源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的组合，主要是一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组的概念最早由澳大利亚学者Marc Wilkins 和 Keith Williams 在1994年提出，而后1995年Wasinger等提出了“蛋白质组学”的概念。现今，随着科技的不断发展，蛋白质组检测技术的不断提高，蛋白质组已经变成了一个大的学科，其中包括一些亚分类如修饰蛋白质组学、尿液蛋白质组学、功能蛋白质组学等。这些亚分类促进了蛋白质组向专业化、系统化发展，从而推动蛋白质组学更广泛的应用。

蛋白质组研究方法复杂，其主要过程为，首先进行蛋白质或肽段分离，然后进行质谱鉴定。在研究早期，主要应用电泳技术分离蛋白质，而后用质谱鉴定。常见的有双向电泳和毛细管电泳技术。双向电泳技术的原理是在丙烯酰胺凝胶上，利用蛋白质的等电点分离（一相）和蛋白质的分子量（二相）对蛋白质进行分离，蛋白质在凝胶上分布成不同的点，最后利用蛋白酶对凝胶上的蛋白质斑点进行酶解消化，最后使用质谱仪鉴定蛋白质的具体种类。还有一种方法是毛细管电泳技术，又称高效毛细管电泳，是一类以石英毛细管作为主要介质，里面填充聚丙烯酰胺凝胶，以高压直流电场为驱动力，使不同蛋白质依据等电点和分子量迁移，最后用质谱鉴定。不过，这两种方法分辨率都比较低，自动化水平比较差，鉴定出的蛋白质数量少，目前已经不是主流的实验技术。

鸟枪法（shotgun）技术的出现提高了蛋白质组的检测效率和范围。鸟枪法是指先将蛋白质酶解成肽段，然后利用纳米级液相色谱进行肽段分离，质谱鉴定出肽段序列，最后拼接出蛋白质。鸟枪法的使用使实验者从繁杂的蛋白质分离过程中解脱出来，逐渐成为主流的实验技术。鸟枪法的关键技术是质谱鉴定技术。随着科技的突飞猛进，质谱技术也日新月异，主要技术包括飞行时间质谱（time of flight mass spectrometry，TOF-MS）、表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术(surface enhanced laser desorption/ionization time of flight massspectrometry,SELDI-TOF-MS)、傅立叶变换离子回旋共振质谱仪（Fourier-transformmass spectrometry,FT-MS）、线性离子阱质谱仪（linear ion traps inmass spectrometry，LIT）、 四极杆离子阱质谱(quadrupole ion trap mass spectrometry)以及Obitrap等技术。这些技术又可以相互结合，组合成各种质谱仪，从而提高质谱的检测效能。基于质谱技术的发展与成熟，利用鸟枪法技术可以在人或动物组织中鉴定出6 000~9 000种蛋白质，已经越来越接近全蛋白质表达谱了。

最近，蛋白质芯片检测技术逐渐兴起。其主要原理是通过建立蛋白质抗体的微阵列，大规模检测蛋白质表达水平。根据芯片的载体不同，分为固相蛋白质芯片和液相蛋白质芯片。蛋白质芯片检测灵敏度高，需要样本量少，而且可以定制具体的蛋白质种类，尤其是可以检测表达量低的蛋白质如细胞因子、转录因子等，由此也成为了蛋白质组学研究的有益补充。

 

二、蛋白质组学在肾脏疾病研究中的应用

尿液是研究肾脏疾病最好的生物标志物来源，大约30%的尿液蛋白质来源于肾脏，70%来源于血液。许多研究人员利用不同的技术建立正常人尿液蛋白质组。如2006年，Adachi等［1］使用线性离子阱与轨道离子阱质谱技术找到了1 543种蛋白质。2009年，Kentsis等［2］使用液相色谱质谱分析技术鉴定出了2 362种尿液蛋白质。2010年，Li等［3］鉴定出了尿液中59个蛋白磷酸化位点。2017年，DiMeo 等［4］在尿液中鉴定出2 091种蛋白。不过，尿液蛋白质组研究也有局限，不同单位的研究结果尿液蛋白质组存在非常大的差异，说明不同检测技术对蛋白质组结果影响较大。相比与尿液蛋白质组，正常人血清和（或）血浆蛋白质组的研究显得更加困难。这主要是因为血清和（或）血浆中含有大量高丰度的蛋白质，如白蛋白、球蛋白、转铁蛋白等等。这些高丰度蛋白质会干扰质谱，使得检测低丰度蛋白质如细胞因子变得非常困难。目前，单个实验室血清和（或）血浆中可以找到的高可信度蛋白质不到1 000个［5］, 而汇总了不同实验室的数据，血清和（或）血浆中的蛋白质不到2 000个［6］。可见，不论是尿液还是血液，仍然需要提高检测技术，增加检测的蛋白质数量，才能建立更全面的蛋白质表达谱。

基于正常人尿液和血液蛋白质表达谱的建立，众多学者希望利用蛋白质表达谱找到肾脏疾病生物标志物。IgA肾病是中国主要的原发性肾小球疾病，尿液蛋白质组检测结果显示：尿液中一些上调的差异蛋白质主要包括：转铁蛋白、补体C3、IGFBP7、铜蓝蛋白、α-1-微球蛋白、血红素结合蛋白、载脂蛋白A-I、维生素D结合蛋白、β-2-微球蛋白、视黄醇结合蛋白、CD44、糖蛋白2、Vasorin、CD300分子样家族成员G、原钙黏素-1、分泌球蛋白家族1A成员1、 二肽基肽酶4、CD84 ［7-10］，而下调的蛋白质主要包括基底膜聚糖层粘连蛋白G样3肽、表皮细胞生长因子、Igκ轻链和层粘连蛋白G样蛋白3［11- 12］。也有少量研究IgA肾病血清中的生物标志物，如Sogabe 等［13］发现补体C4a desArg在IgA肾病患者血清中显著升高，与肾脏损害严重程度相关。

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的严重并发症之一。随着生活方式的改变和饮食结构的变化，糖尿病患病率逐年上升，尤其是中国，糖尿病的患病率已经达到了10%以上，糖尿病肾病的患病率也逐年增加。目前已经发现α2-HS-糖蛋白、维生素D结合蛋白、细胞外基质蛋白1、补体因子H、肌红蛋白、CD59、糖蛋白、抗胰蛋白酶、α-1微球蛋白和电压依赖性电离子通道1等在糖尿病患者尿液中含量增加，而胰淀粉酶和脱氧核糖核酸酶的在尿液中含量是下调的［14］。也有学者利用尿液中外泌体进行质谱检测，发现糖尿病肾病尿液外泌体中的钙调素（regucalcin）显著下降，且钙调素在糖尿病肾组织中也显著下降，提示外泌体中的钙调素可能是重要的糖尿病生物学标志物［15］。不过，需要注意的是，在IgA肾病和糖尿病肾病患者尿液里含量上升的蛋白质，通常与肾脏的损伤相关。许多蛋白质不仅在以上两种疾病中增加，同时在其他肾小球疾病患者尿液中也增加，提示这些蛋白质并不能作为特异性的标志物。但是表达下调的蛋白质和外泌体有可能是特异性标志物。

蛋白质组学在肾脏病最成功的应用莫过于膜性肾病。膜性肾病是成年人肾病综合征最常见的原因。由于环境污染等因素，中国膜性肾病逐年升高。2009年，Beck等［16］使用免疫共沉淀及LC-MS技术从膜性肾病患者的血液中找到了特异性自身抗-M型磷脂酶A2受体 （M- phospholipidase A2 receptor,M-PLA2R）抗体，在大规模人群验证之后，证明抗-PLA2R抗体在特发性膜性肾病的检出率性约70%，特异性接近100%，此抗体的发现是膜性肾病最具突破性的研究进展。在特发性膜性肾病中，PLA2R 抗体结合到足细胞上的抗原，形成免疫复合物沉积，诱导了足细胞损伤产生蛋白尿。由此可见，与发病机制密切相关的生物标志物才是最适合临床应用的标志物。此外，也有一些研究膜性肾病尿液微泡中的蛋白质表达谱，发现膜性肾病患者的溶酶体膜蛋白-2的表达是正常人的两倍［17］，也可能是重要的生物标志物。

而最有可能下一步突破的生物学标志物是急性肾损伤生物标志物。目前，临床上主要以血清肌酐的升高或尿量的减少作为临床急性肾损伤的依据。但是由于血清肌酐升高和尿量减少一般发生在肾脏已经出现明显的损伤后，因此，这些指标不能发现早期的肾损伤。蛋白质组学研究结果显示：肾损伤分子1、基质金属蛋白酶的组织抑制剂1、白介素18、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白7都是急性肾损伤的标志物，其中肾损伤分子1、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白在检测急性肾损伤时的敏感性和特异性都显著高于血清肌酐［18-20］。可见，这些生物标志物可能在不远的将来替代血清肌酐检测成为急性肾损伤标志物。

 而目前急需要寻找的生物学标志物是肾癌的尿液标志物。肾癌是泌尿系统高发的肿瘤，其中肾透明细胞癌占肾癌的60%~85%，是最常见的肾实质肿瘤。肾癌早期临床症状轻微，不易引起注意，发现时经常已经到了中晚期。肾癌细胞在生长扩散过程中，会分泌蛋白质和破坏肾小管，这些分泌蛋白质和损伤的小管蛋白质会进入尿液中，因此肾癌是最有可能在尿液找到生物标志物的肿瘤，研究结果显示尿调素、纤维蛋白原、触珠蛋白，热休克蛋白27、基质金属蛋白酶2和9、基质金属蛋白酶的组织抑制剂2、肾脏肾损伤分子1、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白［21-24］在透明细胞癌尿液中上调。但是，其中的一些指标的升高可能与肾癌导致肾小管损伤相关，与其他肾小管损伤性疾病并不能区分，缺乏特异性。也有学者利用蛋白质组学在肾透明细胞癌尿外泌体中寻找潜在的生物标志物，发现基质金属蛋白酶9、血浆铜蓝蛋白、Podocalyxin (PODXL)、Dickkopf 相关蛋白4 和 碳酸酐酶9 在肾癌的尿外泌体显著上升,而水通道蛋白1、细胞外质金属蛋白酶诱导蛋白、中性内肽酶、二肽酶1和Syntenin-1在肾癌的尿外泌体中显著减少 ［25］。但是，这些标志物缺乏特异性。即目前仍然没有肾透明细胞癌的特异性标志物。

 

三、肾脏蛋白质组学研究的实践

解放军总医院全军肾脏病研究所利用蛋白质组学进行了系膜增殖性肾炎的分子机制研究。首先，他们建立了经典的系膜增殖模型大鼠抗Thy1肾炎模型，该模型是自限性模型，通过尾静脉注射抗Thy1抗体，肾脏早期出现系膜溶解，而后在注射抗体后的第5天发生系膜增殖。在第14天逐渐恢复正常。将模型分为系膜溶解期（注射抗体后第3天），系膜增殖期（注射抗体后第5和第7天），系膜增殖消退期（注射抗体后第10和14天）共6组。提取各组大鼠肾小球，通过荧光差异显示双向电泳技术，找到了差异蛋白质，发现四个半LIM域蛋白2（four and ahalf LIM domains protein 2，FHL2）在第3天表达下降而后逐渐恢复，与系膜溶解期的细胞凋亡密切相关［26］。他们进一步利用细胞模型研究FHL2调控系膜细胞凋亡的分子机制。首先建立了FHL2低表达细胞模型，利用LC-MS分析蛋白质组变化，发现FHL2调控系膜细胞凋亡的分子通路［27］。此外还对抗Thy1肾炎模型血清进行了蛋白质组学检测，发现维生素结合蛋白含量上升和Vanin3含量下降，可能是系膜增殖的分子标志物［28］。

总之，蛋白质组学在肾脏病发病机制研究以及生物标志物的筛选中发挥了重要作用，但是目前还没有找到常见的肾脏疾病以及肾癌特异性标志物。一部分原因是生物标志物疾病特异性差，还有部分原因是临床上习惯用现有的生物标志物，而没有大力验证和推广新的标志物。此外，质谱仪价格昂贵且不适合大规模临检样本检测，也限制了质谱仪在大规模样本检测中的应用。加强生物标志物疾病特异性研究，积极推广新的生物标志物，以及质谱仪性能优化并降低成本问题，期待科研人员去研究解决。

 

参考文献（略）

吕杨,谢院生,陈香美.蛋白质组学在肾脏疾病研究中的应用［J/CD］.中华肾病研究电子杂志,2017，6(2)：54-57.