定量蛋白质组学揭示长链非编码RNA MALAT1与蛋白DBC1相互作用进而调控p53的乙酰化

        肺腺癌转移相关转录子1（MALAT1,Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1）是一种参与诸多细胞过程的长非编码RNA（lncRNA）。该分子于2003年由Ji等在观察早期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的转移现象时被发现，并因此得名。体内和体外实验均证明，MALAT1的过表达可促进细胞增殖、侵袭以及转移，并且MALAT1与多种组织恶性肿瘤均显著相关。已有研究表明，MALAT1可调控肿瘤细胞凋亡调节通路中的半胱天冬酶-3(Caspase-3)，进而调控肿瘤细胞增殖和侵袭。此外，MALAT1还可调节靶蛋白AKAP-9 ，促进结直肠癌侵袭。因此，全面了解MALAT1与蛋白质的相互作用网络，有助于深入理解其分子功能。今天为大家介绍一篇通过高通量蛋白组学研究策略，解析MALAT1与蛋白质的相互作用谱，并研究其分子功能的文献。

        第一步，作者采用RNA pull-down技术分离了lncRNA–protein复合体，将HepG2细胞系用轻标SILAC（Stable isotope labeling byamino acids in cell culture）标记后，与合成的MALAT1序列孵育，同时采用反义MALAT1序列作为阴性对照，与重标SILAC标记的细胞系孵育，之后采用磁珠抓取RNA-蛋白质复合体，再进行胶内酶切以及质谱鉴定。实验流程见下图1。

图 1 SILAC结合RNA pull-down技术鉴定MALAT1特异结合的蛋白质

 

        采用RNA pull-down技术，结合蛋白质组学的方法，鉴定到1584个蛋白，其中符合差异表达蛋白的筛选标准（倍数大于等于2，SD ≤ 0.2 ）的127种蛋白质，被认为是与MALAT1特异结合的蛋白质。为了进一步分析这些蛋白质的功能，作者采用Panther软件进行GO（geneontology）基因功能注释，借助DAVID软件进行蛋白质结构域的分析，并采用KEGG数据库分析相关信号通路。之后，采用PPI（Protein-protein interact）数据库构建相互作用的网络，最后寻找到788条相互作用关系，并选取了4种关键差异蛋白进行验证。结果见下图2。

图 2 采用生物信息学技术构建MALAT1-蛋白质相互作用网络图

 

        第二步，作者挑选了蛋白质DBC1进行后续的机制研究。DBC1是一种核蛋白，它与多种去乙酰化酶相互作用，在基因表达调控中具有重要功能。作者首先通过western blot验证DBC1与MALAT1具有相互作用，并构建了多种DBC1的氨基酸序列片段，最终确定DBC1与MALAT1发生结合的主要结构域位于aa120–280区域。结果见下图3。

图 3 MALAT1 可直接与DBC1的aa120–280 区域结合

 

        第三步，在证实了MALAT1与 DBC1具有相互作用的关系后，作者进一步研究了二者相互作用对细胞功能的影响。目前已知DBC1可与去乙酰化酶SIRT1结合，进而抑制其蛋白去乙酰化的活性。因此，作者重点关注MALAT1与 DBC1的结合是否影响SIRT1的功能。首先通过siRNA技术，作者发现MALAT1可与SIRT1竞争性结合DBC1。MALAT1的高/低水平表达可以增强/抑制SIRT1的活性。这表明MALAT1可以通过与DBC1结合进而调控 SIRT1的活性。之后，通过文献调研，发现在肿瘤发生中具有重要功能的p53是SIRT1去乙酰化的底物，因此作者研究了MALAT1与p53乙酰化水平的关系，并明确了MALAT1-DBC1-SIRT1-P53这条信号调控轴。结合免疫共沉淀技术（Co-IP），体外转录以及酶活实验，作者发现MALAT1通过与DBC1结合，降低p53的乙酰化，并调节p53的转录活性。

        第四步，在分子层面证实MALAT1与DBC1的作用后，作者采用基因沉默、过表达和挽救实验等，进一步从细胞水平验证MALAT1通过DBC1-SIRT1-P53促进细胞增殖的功能，并构建了相应的机制图。可能的调控机制见图4。

图 4 MALAT1通过与DBC1结合调控HepG2细胞的增殖与凋亡

        此篇文献从在肿瘤侵袭中具有重要功能的分子lncRNA MALAT1出发，首先通过定量蛋白组学结合RNA pull-down技术，寻找特异结合的127种差异蛋白，然后根据文献报道挑选有重要功能的蛋白质DBC1，之后通过细胞实验验证MALAT1通过DBC1影响SIRT1对P53的乙酰化修饰，进而调节下游基因表达，调控细胞增殖。

参考文献：

Quantitative proteomics reveals that long non-coding RNA MALAT1 interacts with DBC1 to regulate p53 acetylation.Nucleic Acids Research, 2017, Vol. 45, No. 17

文献整理人：李梦林；编辑：生宁  张金兰；第71期