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这个荧光蛋白亮不亮?这个荧光蛋白成熟快吗?最牛的荧光蛋白是谁-系统描述荧光蛋白特性

生物极客 2022-07-31 08:02:57

这种荧光蛋白亮吗?


好用吗?光谱如何? 


最重要的成熟快吗?影不影响观察?


荧光蛋白(FPs)的慢速成熟时间限制了诸如基因表达动力学等快速过程测量的时间准确性,并有效地降低了生长细胞中的荧光信号。

在最新的Nature Methods中,科学家们使用高精度时间推移显微镜来表征在大肠杆菌细胞的两种不同温度下跨越可见光谱的50个FP的成熟动力学。从这组中鉴定了快速成熟的FPs,可以产生最高的信噪比和时间分辨率--王牌荧光蛋白。



详细解读:

FP通常用于监测各种生物系统中的动态细胞过程。然而,新生的FPs必须经历随机成熟步骤才能发出荧光;该成熟过程的动力学直接影响生物过程可以被监测的准确度。尽管许多研究已经详尽地测量FP的体外特征,但是活细胞中FPs的成熟时间仍然很少数据,并且没有建立单一的“黄金标准”方法来进行这样的测量。缺乏系统的成熟测量可能是由于成熟过程的固有复杂性,除了β-桶的折叠,发色团的扭转重排,环化,氧化和脱水之外,还涉及成熟过程。然而,即使这些过程的全部细节还没有被完全理解,系统的活性细胞中FPs成熟时间的经验性表征将是非常有价值的,因为这将有助于研究人员选择最快的成熟蛋白质或意识到一些假的现象。

(更全表格参见网址:

https://www.nature.com/articles/nmeth.4509/tables/1)

为了高精度地测量成熟动力学,科学家们使用了琼脂糖为基础的单细胞恒化器,从而能够成像和追踪数百个细菌菌落,在严格管理的环境中以指数形式增长超过30代)。这种设置也使我们能够精确控制氯霉素的传递,氯霉素是一种广泛用于评估成熟时间的翻译抑制剂。当产生FP的细胞暴露于该药物时,翻译迅速被终止,但FP成熟继续。尽管没有新合成的FPs,由于先前合成的蛋白质成熟并变得可见,荧光信号仍然继续增加。从荧光增加,科学家们量化翻译停止时的未成熟蛋白质的分数,并提取成熟动力学。我们通过将曝光时间降低到最低值(补充说明),有效地消除了我们测量的光漂白现象。


FP熟化通常被建模为具有单指数动力学和特征半衰期(t50)的一阶过程。然而,观察到高度多样化的成熟动力学,即使是形成相同发色团的FP也是如此。一些变体,如mEGFP,表现出简单的一级动力学 - 作为时间函数的未成熟蛋白质分数遵循单指数。然而,其他变体,如mGFPmut2,成熟更好地描述了两个指数,表明在成熟过程中有效的两个动力学步骤。在第三个例子中,野生型GFP(wtGFP)的成熟率最初是缓慢的,但是逐渐变快。这些“复杂的成熟”动力学不是由多聚化引起的,因为引入单体取代A206K到wtGFP(mwtGFP)导致相同的成熟曲线。先前在红色FPs中观察到类似的复杂成熟过程。然而,来自维多利亚水母(FPV)(例如,moxGFP,SCFP1,mTurquoise2和mClover3)的几种FP也显示出复杂的成熟动力学,这表明这种动力学不是红色FP的专有性质。鉴于成熟动力学的多样性,选择报告两种有效的成熟时间t50和t90,分别对应于50%或90%的荧光蛋白分别成熟所需的时间。尽管不同成熟动力学背后的确切机制尚不清楚,但科学家们推测发色团形成残基侧翼的氨基酸可能起着关键作用。





最后,结果显示SCFP3A,mGFPmut2和mVenNB可能是用于监测快速细胞过程的最佳荧光蛋白,并且它们也将分别用于监测青色,绿色和黄色类别中的快速过程的最亮的整体信号。对于橙红到远红的类别,科学家们建议避免慢红成熟的红色荧光蛋白,并注意它们的低聚趋势和发色团的不完全成熟,这有时会在蓝色的黄色部分产生无意的发射光谱。鉴于这些限制,推荐mScarlet-I和mCherry2。