芥菜中:应用分离泛素酵母双杂交探讨NRAMP蛋白与硫氧还蛋白互作

研究背景

芥菜（Brassicajuncea）是一种生长迅速，生物量大，能够积累不同金属离子的生态修复植物。近来发现，自然抗性相关的巨噬细胞蛋白（NRAMP）与金属离子运输有关。为研究金属离子运输过程中，蛋白质间的相互作用，文章应用分离泛素酵母双杂交系统捕获了与BjNRAMP4.1互作的膜蛋白，并对其中的BjHCF164进行了深入研究。

供试材料

芥菜BrassicajunceaPI 211000

研究路线

研究结果

1

BjNRAMP4.1是一个完整的功能性膜蛋白

结果显示，在酵母smf1smf2中BjNRAMP4.1过表达能够促进细胞积累金属元素。下图中EV（empty vector)为空白载体，在对照和培养基中添加EGTA与Mn的培养基上，由于BjNRAMP4.1过表达，使金属累积造成细胞毒性，菌落数量明显少于EV组。而添加EGTA的培养基上，转入BjNRAMP4.1的菌落数明显比转入EV的多，说明BjNRAMP4.1的过表达，抵消了EGTA对金属的螯合作用，推出能够促使细胞累积金属。另外，与质膜标记荧光蛋白共同定位，发现BjNRAMP4.1在芥菜根部细胞质膜上表达。

2

分离泛素酵母双杂结果筛选到50个作用因子（表格中为部分展示，红色线框中为硫氧还蛋白，文中命名为BjHCF164）

 

3

Brassica硫氧还蛋白BjHCF164与拟南芥中AtHCF164同源，含有一个跨膜区域，N端位于胞质侧，C端位于胞外或细胞器腔内。从下图右中（红色和蓝色组）可以看出NubG构建在BjHCF164的N端时，蛋白发生互作，菌落生长。而NubG构建在BjHCF164的C端时，无菌落生长，从而得出结论（不记得原因的同学去看小编写的往期推送噢---膜体系酵母双杂中的载体选择）。其拓扑结构预测如下图上。另外，在分别删除BjHCF164的硫氧还蛋白区域和N端区域后，发现两者的相互作用均显著减弱(黄色圈出的组），说明这两个区域在蛋白互作中起着重要作用。

4

Brassica硫氧还蛋白BjHCF164与BjNRAMP4.1互作发生在芥菜根部，且BjHCF164在叶片叶绿体中也有表达。

5

在细胞中当Mn过量，其他金属减少或增加DTT时这两个蛋白的相互作用增强。

此外

该研究中还发现了BjHCF164与BjNRAMP4.1在叶绿体中也存在相互作用。显示了金属运输与硫氧还蛋白间的相互作用对细胞中金属稳态有重要作用，并且影响植物的光合状态。

参考文献

Marik A, Naiya H, Das M, et al. Split-ubiquitin yeast two-hybrid interaction reveals a novel interaction between a natural resistance associated macrophage protein and a membrane bound thioredoxin in Brassica juncea

出版源：Plant Molecular Biology, 2016, 92(4-5):1-19.

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