蛋白桑:桑叶提取物抑菌活性及抑菌稳定性研究

 摘 要 ： 分 别用 沸 水 、70% 乙醇 、 无 水 乙醇 、 乙 酸 乙酯 、 石 油 醚对 桑 叶 进 行 提 取 ， 采 用 琼 脂 打 孔 法 比 较 不 同 溶 剂 提 取 物 对 5 种常见食源性污染菌的抑制作用 ； 并探讨热处理 、 紫外线 、 介质 pH 、 糖和盐对桑叶的 70% 乙醇提取物抑菌活性的影 响 。 结果表明 ：5 种提取物均对测试菌株具有较好的抑菌活性 ， 其中以 70% 乙醇提取物抑菌活性最佳 。 热处理及紫外线 照射对 70% 乙醇提取物的抑菌活性没有明显影响 ； 随着介质 pH 的增大 ， 提取物抑菌活性呈下降趋势 ； 随着蔗糖和氯化 钠浓度的增大 ， 提取物抑菌活性有所增强 。

 桑叶为桑科落叶乔木桑树 （Morus alba L. ） 的叶， 栽培或野生。 我国大部分地区多有生产， 尤以长江中 下游及四川盆地为多。 桑叶的药用首载于 《神农本草 经》 ， 桑叶性味苦 、 甘、 寒， 甘所以益血， 寒所以凉血 。 甘寒相合， 故下气而益阴， 又能止咳， 有补气之功， 是 中医常用清热解毒类中药， 主治热感冒 、 肺热燥咳 、 头晕头疼、 目赤等症。 桑叶营养丰富， 含有人体所需 的18种氨基酸、 7种维生素， 还含有锌、 锰、 钙、 铁等微 量元素 ， 已被国家卫生部正式列入 “ 既是食品又是 资源名单。 近年来， 对桑叶药理作用研究的报 药品” 道渐多， 发现桑叶具有降血糖、 降血脂、 抗肿瘤、 抗氧 化、 增强免疫力 、 抗炎 、 抑菌 、 抗病毒 、 抗凝血及扩血 管等作用； 在桑叶抑菌活性方面， 研究表明 ＋ 桑叶汁对大多数革兰氏阳性 （G ） 和革兰氏阴性 （Gˉ ） 细菌以及部分酵母菌的生长具有较强的抑制作用， 且具有热稳定性强， 抑菌浓度低， 抑菌pH范围广的特 点。 研究表明桑叶提取液对微球菌的抑制最 强， 其次为沙门氏菌和大肠杆菌， 对枯草芽孢杆菌的 作用较弱； 在酸性条件下， 桑叶水煎剂的抑菌作用都有不同程度的增加。 可见， 桑叶作为抑菌剂是具有开 发价值的， 目前对桑叶水提物抑菌稳定性的研究有报道， 但桑叶醇提物的抑菌稳定性的研究还未见报道。 为了更系统地探讨桑叶提取物的抑菌活性， 本研究比 较了5种不同溶剂提取的桑叶提取物对5种常见食源 性污染菌的抑菌活性， 并对70%乙醇提取物的最低抑 菌浓度以及抑菌稳定性进行探讨， 以期为桑叶的深度 利用和开发新型天然食品防腐剂提供理论依据。 Vol . 33 , No . 09 , 2012 观察其颜色变化。每一浓度梯 入各孔， 继续培养4h， 度做3组平行实验， 重复2次。 1.2.4 抑菌稳定性的研究 1.2.4.1 热处理对桑叶提取物抑菌活性的影响 将 100mg/mL的70%乙醇提取物分别置于40、 60、 80、 100℃ 水浴及121℃高压湿热条件下处理 30min，以未加热 处理的样品作为对照。采用2倍稀释法， 以金黄色葡 萄球菌为供试菌株， 测定MIC。 1.2.4.2 紫外线对桑叶提取物抑菌活性的影响 将 100mg/mL 的 70% 乙醇提取物分别在紫外灯 （254nm ） 下照射10、 15、 20、 25、 30min， 以未经紫外线照射的样 品作为对照。采用2倍稀释法， 以金黄色葡萄球菌为 供试菌株， 测定MIC。 1.2.4.3 介质pH对桑叶提取物抑菌活性的影响 分别 用0.1mol/L的HCl和0.1mol/L NaOH溶液调节营养肉汤 的pH， 制成pH分别为5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0的营养肉汤 培养液， 以未调pH的营养肉汤培养液作为对照。 采用2 倍稀释法， 以金黄色葡萄球菌为供试菌株， 测定MIC。 1.2.4.4 糖浓度对桑叶提取物抑菌活性的影响 分 别配蔗糖浓度为0.02、 0.04、 0.06、 0.08、 0.1g/mL的营养 肉汤培养液，以不加蔗糖的营养肉汤培养液作为对 照。 采用2倍稀释法， 以金黄色葡萄球菌为供试菌株， 测定MIC。 1.2.4.5 盐浓度对桑叶提取物抑菌活性的影响 分别 配NaCl浓度为0.6、 0.8、 1.0、 1.2、 1.4g/100mL的营养肉汤 采用 培养液， 以不加NaCl的营养肉汤培养液作为对照。 2倍稀释法， 以金黄色葡萄球菌为供试菌株， 测定MIC。 1 1.1 材料与方法 材料与仪器 桑叶 2010年11月采自广东省农业科学院大丰 实验基地国家桑树种质资源分圃 ， 桑叶洗 净后在 50℃ 下烘干， 粉碎， 过 60 目筛， 得桑叶粉末备 用； 金黄色葡萄球菌 （Staphyloccocus aureus ） 、 枯草芽 ） 、 大肠杆菌 （Escherichia coli ） 、 孢杆菌 （Bacillus subtilis 沙门氏菌 （Salmonella spp. ） 、普通变形杆菌 （Proteus vulgaris ） 购自广东省微生物菌种保藏中心； 营养琼 脂培养基， 营养肉汤培养基。  1.2 实验方法 1.2.1 桑 叶 提 取 物 的 制 备 称 取 桑 叶 粉 末 20g 于 500mL的三角瓶中， 以1∶20的料液比分别加入 70% 乙 醇溶液 、 无水乙醇 、 乙酸乙酯和石油醚进行混合， 在 40℃恒温水浴振荡器上振荡24h， 过滤， 收集滤液。另 称取桑叶粉末20g， 以料液比1∶20， 水煎煮2h， 过滤， 收集滤液。无水乙醇、 乙酸乙酯、 石油醚提取物直接旋 转蒸发浓缩得到浸膏， 于通风橱中风干。70%乙醇提 取物浓缩除去乙醇后， 真空冷冻干燥。 水提物浓缩后 真空冷冻干燥 。 实验前将 5 种提取物用二甲基亚砜 （DMSO ） 溶解， 配成100mg/mL溶液备用。 1.2.2 桑叶提取物抑菌效果的测定[7-8] 制备营养琼脂 平板， 用无菌移液器移取200μL菌液 （1.5×107CFU/mL ） 用直径为6.0mm的琼脂于平板上， 用涂布棒涂布均匀。 打孔器均匀打孔， 每板 4 孔， 去除孔内琼脂并适当封 闭孔底。 各取40μL不同溶剂桑叶提取物及对照品溶液 （DMSO ） 加于孔内， 放置 1h， 使样品溶液及对照品溶 液扩散。以上操作均在超净工作台上完成。然后置 37℃生化培养箱中培养 24h， 采用十字交叉法测量抑 菌圈直径。实验重复3次， 取其平均值为测定结果。 1.2.3 最小抑菌浓度 （MIC ） 的测定采用 2 倍稀 释法， 以 DMSO 为溶剂， 将桑叶的 70% 乙醇提取物配 制一系列梯度浓度的样品溶液， 待用。在96孔板中， 从A～G行依次加入 每孔加入160μL营养肉汤培养液， 一系列梯度浓度的样品溶液20μL，混匀。H行加入 DMSO 作为对 照 。 用 无 菌 移 液 器 吸 取 稀 释 的 菌 液 （1.5×106CFU/mL ） 20μL加入各孔， 补足每孔总体积为 200μL。从A～G行样品终浓度依次为10、 5、 2.5、 1.25、 0.625、 0.312、 0.156mg/mL。培养板在37℃生化培养箱 中培养 20h 后， 将显色剂碘硝基四唑紫 （INT ） 20μL 加 2 2.1 结果与讨论 桑叶不同溶剂提取物的抑菌效果 通过琼脂打孔法测定了桑叶 5 种不同溶剂提取 物对5种食品常见污染菌的抑菌活性，其结果如表 1 所示。 由表1可知， 5种不同溶剂提取物在相同浓度 （100mg/mL ） 下， 对各种供试菌的抑菌活性不同。 其中 70%乙醇提取物对5种供试菌都有抑制作用， 抑制效 果为：枯草芽孢杆菌＞金黄色葡萄球菌＞普通变形杆 菌＞大肠杆菌＞沙门氏菌 （按照抑菌圈直径大小 ） 。沸 水提取物除对枯草芽孢杆菌没有抑制作用外，对其 余4种供试菌都有一定的抑制作用。 乙酸乙酯和石油 醚提取物对供试革兰氏阳性菌 （金黄色葡萄球菌 、 枯 草芽孢杆菌 ） 有较强的抑制作用， 对供试革兰氏阴性 菌 （大肠杆菌、 沙门氏菌、 普通变形杆菌 ） 没有抑制作 用。 乙醇提取物只对金黄色葡萄球菌有抑制作用。 可 见，沸水提取物和70%乙醇提取物中的成分对革兰 氏阳性菌的抑制作用强于革兰氏阴性菌，这与梁薇 等发现桑叶水提物及醇提物均对金黄色葡萄球菌 有较明显抑菌及杀菌作用， 对变形杆菌 、 绿脓杆菌 、 大肠杆菌也有一定的抑菌或杀菌效果的结论一致 。 而乙酸乙酯和石油醚提取物中的成分只对革兰氏阳 性菌有较强的抑制作用。这可能是由于桑叶提取物 的抑菌活性与其含有的活性物质种类与数量存在直 接的联系，不同溶剂提取的桑叶提取物中含有的活 性物质不同， 因而表现出了不同的抑菌活性。 2012 年第 9 期 89 Science and Technology of Food Industry 研究与探讨 Table 1 浸提液 表1 桑叶不同溶剂提取物的抑菌效果 Inhibition zone diameters of different extracts from Morus alba L. against 5 common foodborne pathogenic 金黄色葡萄球菌 11.00±0.40 12.00±0.34 11.36±0.11 12.46±0.31 13.60±0.26 6.00±0.00 枯草芽孢杆菌 6.00±0.00 12.43±0.49 6.00±0.00 10.13±0.38 11.30±0.47 6.00±0.00 ） 抑菌圈直径 （mm 大肠杆菌 9.80±0.00 9.87±0.18 6.00±0.00 6.00±0.00 6.00±0.00 6.00±0.00 沙门氏菌 9.40±0.40 9.03±0.18 6.00±0.00 6.00±0.00 6.00±0.00 6.00±0.00 普通变形杆菌 10.23±0.16 10.80±0.20 6.00±0.00 6.00±0.00 6.00±0.00 6.00±0.00 沸水 70%乙醇 乙醇 乙酸乙酯 石油醚 空白对照 （DMSO ） 注： 直径为6.00mm， 表示未观察到明显抑菌圈。 2.2 70% 乙醇桑叶提取物对不同供试菌的 MIC 采用2倍稀释法， 测定70%乙醇桑叶提取物对不 其结果如表2所示。 同供试菌的MIC， 表2 桑叶70%乙醇提取液对不同供试菌的MIC比较 Table 2 MICs of 70% ethanol extract from Morus alba L. against 5 common foodborne pathogenic bacteria 金黄色 枯草芽孢 大肠 普通变形 沙门氏菌 杆菌 葡萄球菌 杆菌 杆菌 MIC （mg/mL ） 2.5 2.5 10 10 10 供试菌种 由表2可知， 70%乙醇桑叶提取物对不同供试菌 枯草芽孢 具有不同的抑菌效果： 对金黄色葡萄球菌、 杆菌有较好的抑制效果， MIC为2.5mg/mL；对大肠杆 菌、 沙门氏菌、 普通变形杆菌的MIC均为10mg/mL。由 此可知， 70% 乙醇桑叶提取物对供试革兰氏阳性菌 的抑制作用强于供试革兰氏阴性菌。 2.3.3 介质pH对提取物抑菌活性的影响 介质不同 pH对桑叶提取物抑菌活性的影响结果如表5所示。 由 表5可知， 随介质pH的升高， 桑叶提取物对菌体的抑 酸性条件下抑菌活性较强， 当营养 制能力不断下降。 肉汤培养液的pH=5时， 培养液本身就能抑制金黄色 葡萄球菌的生长。 碱性条件下抑菌活性显著降低， 这 可能是由于碱性环境破坏了桑叶提取物中抑菌性物 质的结构 （或活性 ） 。 表5 介质pH对提取物抑菌活性的影响 Effect of pH on antibacterial activity of 70% ethanol extract from Morus alba L. 5 — 6 1.25 7 2.5 8 5 9 10 对照 2.5 Table 5 介质pH MIC （mg/mL ） 注： “—” 表示营养肉汤培养液的pH=5时， 未加样品溶液， 培养 液本身就能抑制金黄色葡萄球菌的生长。 2.3.4 糖浓度对提取物抑菌活性的影响 培养液蔗 糖浓度对桑叶提取物抑菌活性的影响结果如表 6 所 示。 由表6可知， 随着培养液中蔗糖浓度的升高， 桑叶 提取物抑菌能力有增强的趋势 。 当蔗糖浓度在 0 ～ 0.04g/mL时， MIC均为2.5mg/mL， 说明蔗糖浓度较低时， 桑叶提取物抑菌能力的变化不明显； 当蔗糖浓度在 0.06～0.1g/mL时， MIC 减小到 1.25mg/mL， 说明当蔗糖 ） ， 提取物抑菌能力随之增 达到一定浓度后 （0.06g/mL 强。这表明蔗糖对桑叶提取物的抑菌活性具有一定 的增效作用， 原因可能是当蔗糖达到一定浓度， 能够 影响微生物生长的渗透压， 从而抑制细菌的生长。 表6 糖浓度对提取物抑菌活性的影响 Effect of saccharose on antibacterial activity of 70% ethanol extract from Morus alba L. 0.04 2.5 0.06 1.25 0.08 1.25 0.1 1.25 对照 2.5 2.3 70% 乙醇桑叶提取物抑菌稳定性的研究 由于 70% 乙醇提取物的抑菌活性较好， 因此以 金黄色葡萄球菌为指示菌， 对该提取物的抑菌稳定性 进行研究。 2.3.1 热处理对提取物抑菌活性的影响 热处理对 由表3可知， 提取物抑菌活性的影响结果如表3所示。 桑叶提取物经不同温度处理后， MIC值均为2.5mg/mL， 抑菌活性基本保持不变， 即使在 121 ℃ 处理 30min 后 仍具有较高活性， 表明桑叶中的抑菌成分具有较高 的热稳定性。 这与樊黎生得出桑叶汁抗菌成分具备 良好抗热性的结论一致。 表3 温度对提取物抑菌活性的影响 Effect of temperature on antibacterial activity of 70% ethanol extract from Morus alba L. 40 2.5 60 2.5 80 2.5 100 2.5 121 2.5 对照 2.5 Table 3 Table 6 温度 （℃ ） MIC （mg/mL ） 蔗糖浓度 （g/mL ） 0.02 MIC （mg/mL ） 2.5 2.3.2 紫外线对提取物抑菌活性的影响 紫外线对 提取物抑菌活性的影响结果如表4所示。 由表4可知， 随紫外线照射时间的变化， 提取物的抑菌活性基本 保持不变， 说明桑叶中的抑菌成分对紫外线具有极 高的稳定性。 表4 紫外线对提取物抑菌活性的影响 Effect of ultraviolet on antibacterial activity of 70% ethanol extract from Morus alba L. 15 2.5 20 2.5 25 2.5 30 2.5 对照 2.5 Table 4 紫外线照射时间 （min ） 10 MIC （mg/mL ） 2.5 2.3.5 盐浓度对提取物抑菌活性的影响 培养液中 NaCl 浓度对桑叶提取物抑菌活性的影响结果如表 7 所示。 由表7可知， 随着培养液中NaCl浓度的升高， 桑 叶提取物抑菌能力有增强的趋势。当 NaCl浓度较低 （0.5~1.0g/100mL ） 时， MIC均为2.5mg/mL， 说明低浓度 的NaCl对桑叶提取物的抑菌能力影响不明显； 当NaCl 浓度达到 1.2 ～1.4g/100mL 时， MIC 减小到 1.25mg/mL， 说明当NaCl达到一定浓度 （1.2g/100mL ） 时， 桑叶提取 物抑菌能力增强。这表明NaCl对桑叶提取物的抑菌 活性具有一定的增效作用， 原因可能是当NaCl达到一定浓度， 能够影响微生 物生长的渗透压， 从而抑制细菌的生长。  3 结论 5种溶剂桑叶提取物对5种常见食源性污染菌具 有不同的抑制作用， 其中以70%乙醇提取物的抑菌效 果最好， 其对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的MIC 均为 2.5mg/mL； 对大肠杆菌 、 沙门氏菌 、 普通变形杆 菌的MIC均为10mg/mL。 热处理和紫外线照射对 70% 乙醇桑叶提取物的 抑菌活性无明显影响； 随着介质pH的增大， 提取物抑 菌活性呈下降趋势；蔗糖和氯化钠对提取物的抑菌 活性具有一定的增效作用。 由此可见， 桑叶抑菌活性 成分具有良好的稳定性，即使经过食品加工中常见 的热处理和紫外杀菌， 也可保持良好的抑菌性能。 本文主要考察了桑叶提取物的抑菌活性及其稳定 性， 而对于其中发挥主要抑菌活性的物质组成还未能明 确。 本课题组下一步将进行桑叶主要抑菌活性物质的 分离纯化与结构分析研究， 从而明确抑菌的物质基础。

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