福建水产设备联盟

Nat. Methods | 活细胞鉴定RNA-蛋白互作组学

王初课题组 2020-03-25 13:26:56

     大家好,今天为大家推荐一篇来自Nature Methods的文章:RNA–protein interaction detection in living cells,本文的通讯作者为斯坦福大学医学院Paul A Khavari教授、医师,主要研究方向为皮肤肿瘤治疗以及生物机制。

    在细胞全蛋白质组中,大约5%的蛋白能与RNA发生相互作用。这些蛋白起到了调控转录、剪切、翻译的功能,并对基因组稳定、特定基因表达产生影响。然而,现有检测RNA-蛋白相互作用的方法并不能反映活细胞中的真实情况。本文开发了一套基于酶标记手段检测RNA-蛋白相互作用的方法(RNA-protein interaction dectection, RaPID),使得活细胞检测RNA-蛋白相互作用结果更加可靠。他们利用了一种来自大肠杆菌的生物素连接酶: BirA,它能在10nm距离内的任意蛋白上共价连接生物素分子。在BirA的N端上连接λN肽段(含22个氨基酸),便可以和BoxB茎环的RNA结构牢固结合。将BoxB茎环结构连接到待分析的RNA序列两端,便能对于该RNA发生作用的蛋白进行标记,以便后续富集、质谱分析。


     首先,作者用已知的RNA-蛋白作用(EDEN15-CELF17等)对方法进行验证,并用人工合成的已知RNA片段与蛋白互作测试特异性;然后,就是RaPID各种大显身手了:


(1)研究疾病发病机制:遗传性白内障综合征是由于FTL基因mRNA的IRE motif发生突变引起的,IRE元件的作用蛋白包括IREB2、IRP1等,利用RaPID法研究发现三种遗传性白内障患者特异的IRE突变均会使IREB2结合能力减弱,并导致血浆中铁蛋白浓度升高造成白内障。


(2)寻找病毒RNA作用蛋白:许多病毒的RNA未翻译区(UTR)能与宿主细胞蛋白结合,帮助它们成功翻译、复制。寨卡病毒具有高度亲神经性,为了解释这一现象,使用RaPID法寻找寨卡病毒RNA UTR片段的作用蛋白,鉴定到了QKI这一在神经母细胞中高表达的蛋白。QKI是一类RNA结合蛋白,在神经细胞分化中也起到了关键作用,因此可以解释为什么寨卡病毒感染会导致胎儿畸形。


(3)发现新的RNA-蛋白互作: SM1v1 RNA motif 在转录组中的降低与RC3H1(一种结合并促进RNA降解的蛋白)过表达均与乳腺癌不良预后相关,利用RaPID,本文首次鉴定到了SM1v1与RC3H1的相互作用,暗示两者的关联性。


最后,文章对BirA酶进行了改进,使用改造过的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)生物素连接酶,使得生物素标记效率比之前大大提高,将这一方法命名为RaPID BASU。


    总之,本文开发出了新的RNA-蛋白相互作用检测方法用于活体细胞,以几个有意义的生物学实例证明了方法的可靠性和实用性,并进一步通过结构-功能研究优化了酶的标记效率,为研究RNA-蛋白互作提供了重要工具。



doi:10.1038/nMeth.4601


链接:http://www.nature.com/articles/nmeth.4601.pdf