蛋白纯化那些事儿(一)

2023-05-10 14:56:27

纯化蛋白已经是科研工作者非常日常的工作,动物免疫、研究蛋白的功能与结构等其前提都是拿到高纯度的蛋白,制药企业生产蛋白药物,蛋白纯化更是生产的核心内容。纯化,顾名思义,就是要从纷纷扰扰的杂蛋白中,将我们要的目的蛋白分离出来,如何来分?如果所有的蛋白都长得一模一样,那就没辙了,好在细胞内没有完全相同的两个蛋白,就像世界上没有完全相同的两片树叶一样,蛋白与蛋白总是在大小、形状,带电、疏水性、溶解度等方面存在差异,我们就是利用蛋白间的这些差异,或者我们人为地创造目标蛋白与杂蛋白的差异(如带上特异标签),一步步将我们的目标蛋白与杂蛋白分离。

工欲善其事,必先利其器,纯化中非常关键的一个环节就是层析柱。层析,又名色谱,创始于20世纪初,1906年俄国植物学家Tsweet将碳酸钙放在竖立的玻璃管中,从顶端倒入植物色素的石油醚浸取液,并用石油醚冲洗。在管的不同部位形成色带,因而命名为色谱。管内填充物称为固定相(STATIONARY PHASE),冲洗剂称为流动相(MOBILE PHASE)。随着其不断发展,色谱法不仅用于有色物质的分离,而且大量用于无色物质的分离。虽然“色”已失去意义,但色谱法名称仍沿用至今。从技术上分,目前蛋白纯化中主流的层析技术可分为四大类:亲和层析、离子交换、疏水层析、分子筛。亲和层析是目前重组蛋白纯化中用得最多的技术,其原理是特异性的配体配基的结合,如6×his tag标签与Ni2+的特异结合,而不含该标签的蛋白则从层析柱上流穿,因为特异性非常高,通常一步能得到80%以上的纯度。离子交换则是根据不同的蛋白在不同缓冲液环境里带电不一样来进行分离,带负电的蛋白用阴离子交换,带正电的蛋白用阳离子交换,通过提高盐深度(NaCl)来进行梯度流脱。疏水层析与离子交换的低盐上样高盐洗脱相反,蛋白在高盐环境下暴露出疏水基团,与填料上的疏水基因结合,通过逐渐降低盐浓度破坏这种疏水作用实现分离。分子筛纯化的依据则是蛋白的大小和形状的不同,小蛋白进入凝胶孔隙,迁移路径长,后出峰,大的蛋白直接从凝胶颗粒的空隙中穿出,先出峰。由于其分辨率的限制,极小的上样量(<1% CV),且同时可以更换蛋白储存的缓冲液,通常作为纯化路线中的最后一步。


目前市面上有各种高分辨的预装柱可供选择,当然对于要求不高的实验,也可以选择购买填料和空柱,自行装柱,但可能在纯化效果及简便性上会大打折扣。除层析柱,在经常做蛋白纯化或者对蛋白纯度要求较高的实验室,一定会有蛋白纯化仪,它可以大大提高我们的实验效率,也为多步纯化路线的进行提供可能。


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