众所周知，组学分析是一个大规模数据采集的过程，假阳性概率很高，其中不可避免地出现不准确的数据。因此，老师是否对蛋白质组学结果进行了验证，是蛋白质组学数据能否通过编辑关的重要凭借之一。
在蛋白质组研究模式刚开始的阶段，是很少有文章进行验证的，即便是《Molecular & Cellular Proteomics》中也能找到很多。但是随着组学研究的普及，从文章发表的要求来看，验证已经成为标配。现在拿到蛋白组下机结果，分析出了差异蛋白，如何针对得到的蛋白进行验证？想必大家都很苦恼。现在小编就为大家总结一下常见的蛋白组学验证方法。
定性定量
1. 荧光定量核酸扩增检测
荧光定量核酸扩增检测 (Real-time Quantitative PCR Detecting System，qPCR) 作为最常见、最方便的验证方法，广泛应用于测序结果的定性定量研究。找到差异蛋白对应的基因序列，进行设计引物，然后对该基因进行qPCR验证，以此验证该基因的表达丰度，特异性更高。
小编tip：但是我们并不建议用PCR来验证。虽然PCR几乎没什么技术限制，但是PCR反映的是RNA水平的变化，转录水平的变化与蛋白水平并不一定是一致的，所以用PCR验证的说服力相对较低。
2. 蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB ）
除了qPCR，WB验证应该是大家最熟悉的验证方式了。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，通过抗原抗体特异性结合来检测电泳分离的蛋白成分，广泛应用于检测蛋白水平的表达。
小编tip：虽然用抗体验证是一个常规和公认的思路。但目前也有一些对抗体质疑的声音，且WB这类实验的通量较低，多个差异蛋白一个个WB做过来，也是件很要命的事，并且购买定制的抗体的成本也较高，因此大家还是要谨慎些。
3.SRM/MRM/PRM
除了抗体的方法，现在基于质谱的方法也更加普及。相信大家对SRM/MRM技术应该并不陌生。简单来说，SRM/MRM与常规使用的蛋白质组方法label-free 、iTRAQ/TMT并不是一家人，其无论在质谱硬件上还是数据采集模式上均有所不同。
SRM/MRM采用的是基于triple Quadrupole质谱的selected scan模式。借助于这种特殊的数据采集方式，SRM/MRM与WB、ELISA分析一样，可选择性、特异性地对目标蛋白质进行定量分析（或绝对定量分析）。而PRM是一种基于高分辨、高精度质谱（如Orbitrap系列）的离子监视技术，通过选择unique肽段对目标蛋白质、目标肽段（如发生翻译后修饰的肽段）进行选择性检测，从而实现对目标蛋白质/肽段进行准确地特异性分析。这种方法也是杂志社编辑最推荐和最希望看见的方法。
功能验证
1.过表达
通过查询目标蛋白的基因序列，DNA 片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。
2.RNA沉默
通过确定差异蛋白所对应的基因，构建载体，以RNA为靶标, 使其降解或抑制其所对应的蛋白翻译, 从而获得该因素对个体的影响机制。
通过基因过表达或沉默，我们可以将变量控制在单一范围内，有针对的研究某一个特定基因的调控机制。
多组学联合分析
利用其他组学的结果来验证蛋白质组的结果。例如，可以同时监测转录组水平的变化，一方面可以对蛋白质组的结果进行验证，另一方面可以更系统的研究基因的表达及调控机制。
此外，代谢组学位于生物信息流的最终端，可以将基因和蛋白质水平的有效微小变化进行放大，使得机体的生理病理状态更容易被监测。并且，多组学联合也是今年最流行的方法哦。
以上是科研中常用的蛋白质组学验证方法，如果您觉得还有点参考价值，记得给小编点赞哦。时刻关注小美，我们的宝典在持续更新中。。。。。。
蛋白与代谢事业部 文案|李凯敏
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