江南大学开发谷氨酸棒杆菌CRISPR/Cas9基因编辑工具

Efficient gene editing in Corynebacterium glutamicum 

using the CRISPR/Cas9 system

通讯作者：白仲虎教授（江南大学）

发表杂志： Microb Cell Fact

本文开发了一种可对谷氨酸棒杆菌快速有效编辑的CRISPR/Cas9 系统。编辑系统包括两个质粒：一个是包含目标区域guide RNA和同源序列质粒，另一个包含表达Cas9蛋白（密码子优化）质粒。本文利用此系统对影响蛋白表达的四个基因（porB、 mepA、clpX和Ncgl0911）成功敲除，成功率高达100%，同时用该系统进行点突变和基因插入也获得了成功。

文章脉络

1、构建CRISPR/Cas9系统的两个质粒

pFSC质粒：pXMJ19来源，具有密码子优化的S. pyogens Cas9蛋白，GC含量由原来的35%优化到52%；具有经典的SD序列；使用Ptac启动子，IPTG诱导；起始密码子为ATG。

pFST质粒：来源温敏质粒pECXK99E，易消除；使用Ptrc启动子，IPTG诱导；包含同源修复模版。

 

图1：CRISPR/Cas9双质粒系统及sgRNA结构

2、尝试对ATCC 13032和CGMCC1.15647进行基因编辑

敲除porB基因（阴离子选择通道蛋白）：ATCC 13032 阳性率为18/18，CGMCC1.15647（重组蛋白表达常用菌株）阳性率为16/16。

3、不同长度同源修复模版对编辑效率的影响

敲除porB基因：使用长度为1 kb、0.6 kb、0.3 kb、0.1 kb的同源臂，其阳性率分别为100%，83.3%，83.3%和16.7%，其中同源臂长度为0.3 kb时阳性率已达83.3%，说明同源臂为0.3 kb足以进行基因敲除。

4、其他基因敲除

使用0.3 kb同源臂，对ATCC13032菌株的mepA（细胞壁代谢），clpX（蛋白质水解），Ncgl0911（双分子信号系统）三个基因进行敲除，阳性率分别为2/15，5/16，4/15。

5、点突变和插入

对ATCC 13032菌株的porB基因进行6 bp的碱基突变，阳性率为6/6。说明该系统可有效进行点突变。

将绿色荧光蛋白gfp基因插入porB基因处，同源臂为1 kb时阳性率为8/12，同源臂为0.3 kb时阳性率为3/12，说明该系统基因插入有效。

5、不同sgRNAs对编辑效率的影响

因敲除mepA基因编辑效率较低，所以对此基因进行sgRNA优化。通过优化不同靶向位点和靶向不同的模版链和非模版链，发现最佳PAM为GGG，靶向模版链。实验证明，sgRNA序列对基因编辑效率影响较大，sgRNA中GC含量不应高于60%，GC含量55%的sgRNA序列其编辑效率为12/12。

6、脱靶效应

对包含cas9基因的ATCC 13032菌株和用该系统敲除porB基因和mepA基因菌株进行全基因组测序，仅发现敲除porB菌株有一个碱基的缺失突变，其他菌株均无突变，说明该系统的脱靶效应很低。

7、荧光蛋白活性定量分析

    作者曾对谷氨酸棒杆菌在不同溶氧条件下进行转录组分析，得出porB（阴离子选择通道蛋白）、mepA（细胞壁代谢）、clpX（蛋白质水解）、Ncgl0911（双分子信号系统）四个基因在不同溶氧条件下表达水平变化显著。作者认为溶氧是影响菌株代谢和重组蛋白表达的重要因素，所以推测这四个基因对重组蛋白表达有重要影响。

作者将GFP作为模式蛋白来检测基因敲除菌株对重组蛋白表达功能的影响。pXMJ19除去lacIq后组成型表达GFP。实验表明，相比对照菌株，porB、 mepA敲除菌株，荧光蛋白的表达量提高了55.2%和62.4%，说明这两个基因对重组蛋白的表达有着重要影响，但需要进一步研究。

DOI:10.1186/s12934-017-0814-6