探索RNA与蛋白的相互作用,你需要这两种检测

2023-05-10 14:56:27

从DNA到蛋白质，这是一个相当复杂的过程。转录DNA的代码，这只是万里长征的第一步。随后，大量蛋白质编辑RNA，带领它从细胞核到细胞质，控制其稳定性，并指导其翻译。基于这一现象，许多科学家正在鉴定哪些RNA与哪些蛋白质相结合。


印第安纳大学的副教授Sarath Chandra Janga介绍，数百个RNA结合蛋白（RBP）参与了这个过程。Janga正在维护一个人类RNA结合蛋白的数据库，他估计大约有3000个人类蛋白质与RNA结合，其中1400个已通过实验确认。基于这一现象，许多科学家正在鉴定哪些RNA与哪些蛋白质相结合。


科学家有两个主要选择：核糖核蛋白免疫沉淀（RIP）和紫外交联免疫沉淀（CLIP）。两者都利用RNA结合蛋白的抗体来pull down结合的RNA，不过操作方法略有不同。杜克大学医学中心的Jack D. Keene教授表示：“两种方法各有用途，也各有缺点。”Keene教授是研究RNA调控的专家，曾在九十年代发明了最初的方法。


RIP vs. CLIP


在开展RIP检测时，科学家从细胞提取物中拉下蛋白质-RNA复合物，然后利用测序来鉴定那些目标RNA。Keene喜欢这种技术，因为它能带来与RBP天然结合的一切东西。同时，它也是定量的。数据告诉我们，某个RNA结合蛋白究竟与几十个、几百个还是几千个RNA相结合。


不过，经典的RIP检测不会告诉我们，具体哪几个核苷酸在蛋白质的结合位点上；它只是鉴定出一组目标RNA。此外，据Janga介绍，它不仅仅拉下与目的蛋白结合的RNA。许多RNA结合蛋白是相互关联的，因此RIP可能拉下所有关联蛋白，以及它们当时结合的所有RNA。换句话说，在RIP检测中，A的抗体也许会收集同一复合物中与B或C结合的RNA。


CLIP则希望解决这些问题，让免疫沉淀仅限于感兴趣的RBP以及与之互作的RNA。在免疫沉淀之前，科学家利用紫外光让结合的伴侣紧密交联。然后，他们利用酶来剪切所有未受抗体保护的RNA和蛋白质。与RIP一样，科学家随后通过测序来鉴定拉下的RNA。由于大部分未交联的RNA被去除，CLIP可以鉴定出特定的结合序列。


当然，CLIP也存在一些问题。最关键的是，紫外光无法让细胞中所有的RNA-蛋白互作形成交联。这样一来，科学家必须开展试错实验以确定适当的紫外剂量，既保证重要的生物互作形成交联，又避免其他的RNA-蛋白组合来捣乱。


Keene表示：“交联的效率可能只有5%，甚至更低。你也许错过了相当一部分的结合位点。”基于这个原因，CLIP并不像RIP那样是定量的，它无法区分RNA结合蛋白与这个或那个RNA目标的相对亲和力。


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