关键词：蛋白质组、高通量、N-端乙酰化、磷酸化

蛋白质是生物功能的最终执行者，同时也是最复杂的生物大分子之一。蛋白质的复杂性不但是源于本身序列的不同，还体现在多种多样的翻译后修饰层面上。虽然质谱技术的发展极大促进了蛋白质组检测的发展，但是人们对于高通量、高效获得蛋白质组学数据的追求从来没有停止过。比如，2008年首次获得酵母的高覆盖度蛋白质组学数据，当时花费了一周的检测和分析时间。之后随着质谱技术和数据分析的提升，2014年获得同样的数据只需要1.5小时。为了实现尽可能全面的蛋白质组检测，人们发展了很多方法和策略，如不同的预分级方法、延长的运行时间、优化的质谱性能和参数、改良的色谱柱条件、更新的软件搜库算法等等。然而这些方法如何优化整合到一起，真正实现高效、高通量检测，确是一直悬而未决的事情。近期Cell System上的一篇报道综合和各类技术并进行优化，实现了对人类蛋白质组近乎全面的覆盖，引起了人们的广泛关注。该项研究是典型的“集成创新”的例子，各种方法都曾经被报道和使用过，通过合理的优化极大提高了检测的覆盖度和深度，为后续的检测和研究提供了重要的方法上的借鉴。

该研究的基本检测流程如图1所示，采用的是多个短梯度的分级和检测方法。作者几种的体系优化位于四个层面：首先是提高上样量，因为仪器本身Nano LC的载样量限制，作者采用了分多次进样的方式来间接提高上样量。其次，作者采用了优化的高PH反向色谱柱对样品进行预分离，使得不同组分之间的overlap降到最低。第三，为了降低峰宽提高质谱的检测强度并降低整体的检测分析时间，研究者采用了优化的30min短梯度检测，并将不同组分样品检测之间的其他环节时间缩短到15min。第四，为了配合色谱的高流速，研究者使用了新锐的QE HF质谱仪在HCD模式下进行20Hz的高速扫描，以尽可能多地采集离子信号。通过这种模式，研究者在46个组分，每个组分1ug Hela肽段，每组分30min有效梯度的条件下，经过34.5小时检测，使用Maxquant搜库得到166,620个肽段，归属于11,292个protein group，对应10,284个基因，其中每个组分可以鉴定超过4,000个protein group。如果通其他非Trypsin酶切结果合并，则一共可以检测到14,200个蛋白异构体（图2）。此外，在如此高的检测通量情况下，仍然保持了较好的重复性。

蛋白质翻译后修饰种类多样、分布广泛、功能重要，然而由于其在化学计量上往往只占一小部分，通常都需要特殊的方法进行富集方能进行高通量地检测。然而在该研究中，由于超高的分析深度，作者甚至在未经任何富集的情况下直接检测到超过10,000个磷酸化位点，而在TiO₂富集之后的磷酸化位点检测可以超过30,000个，将蛋白质组的检测深度在修饰领域推向了一个新的高度（图3）。然而即便是这样深度，通过和以往数据的比较发现仍然有很多磷酸化位点未能鉴定到，这表示修饰层面具有极高的复杂性，全面的解析仍然需要仪器方法的继续进步。

作者接下来将这个体系运用到其他的癌症细胞系和临床样品中，得到了相类似的检测深度和结果，这表明该方法是普遍适用的（图4）。该项研究综合运用了近年来各个层次的方法改进，并在集成优化的基础上实现了极高深度的检测通量和深度，标志着蛋白质组检测正在真正得走向高通量，必将在未来的生物医学研究和应用中发挥越来越重要的作用。

春华秋实---景杰生物与高水平植物蛋白质组学研究