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western blot 之蛋白含量测定

智睿生物 2019-05-20 13:29:12

WB 实验在提取完蛋白质后,就要对蛋白含量进行测定

测定方法如下:

一、制作标准曲线

1、从-20℃ 取出 1 mg/ml BSA,室温融化后,备用。

2、取 18 个 1.5 ml 离心管,3 个一组,分别标记为 0 μg,2.5 μg,5.0 μg ,10.0 μg ,20.0 μg ,40.0 μg。

3、按下表在各管中加入各种试剂。

4、混匀后,室温放置 2 min。在生物分光光度计上比色分析。

二、 检测样品蛋白含量

1、取足量的 1.5 ml 离心管,每管加入 4℃ 储存的考马斯亮蓝溶液 1 ml。室温放置 30 min 后即可用于测蛋白。

2、取一管考马斯亮蓝加 0.15mol/L NaCl 溶液 100 μl,混匀放置 2 分钟可做为空白样品,将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按 blank 测空白样品。

3、弃空白样品,用无水乙醇清洗比色杯 2 次(每次 0.5 ml),再用无菌水洗一次。

4、取一管考马斯亮蓝加 95 μl 0.15mol/L NaCl NaCl 溶液和 5μ 待测蛋白样品,混匀后静置 2 min,倒入扣干的比色杯中按 sample 键测样品。

注意:每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗 2 次,无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测,这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是 5 μl 样品含的蛋白量。

(上述方法只是一家之言,可以自我变通)