原核表达-GST标签表达蛋白纯化及蛋白质不表达的原因

GST标签蛋白的方法

1. Glutathione Sepharose 4B胶的预处理：

A.取1.33mLGlutathione Sepharose 4B胶原液，1800rpm,5min离心去上清

B. 加入10 mL 1×PBS，轻摇至Glutathione Sepharose 4B胶悬浮于溶液中，1800 rpm，5min离心弃上清

C.加入1mL1×PBS重悬，即可得50%的Glutathione Sepharose 4B胶

2.洗脱液：0.154g还原性谷胱甘肽溶解于50mL 50mmol/LTris-Hcl中，现配用

50mmol/L Tris-Hcl：0.606g Tris-base溶解于足量的蒸馏水中，调节pH值至8.0后，再加蒸馏水定容至100mL

3.诱导200mL菌体，4℃ 12000rpm  1min集菌，然后PBS洗涤诱导后菌体2-3次，1×PBS（一般用1/10体积）重悬菌体，超声波破碎至清亮 ，12000rpm，20min离心取上清，在上清中加入适量经处理过的50%的Glutathione Sepharose 4B胶（一般20ml上清对应1ml胶），室温摇床轻轻晃动令其吸附蛋白1 h；
4. 2000 rpm，5min离心弃上清；
5. 加入至少10倍体积PBS，轻摇至Glutathione Sepharose 4B胶悬浮于溶液中，2000rpm，5min离心弃上清；
6. 重复步骤5两次；
7. 加入1 mL GST Elution Buffer，轻摇10 min；
8. 2000 rpm，5 min离心，收集上清；
9. 重复步骤7-8至少两次；
10. SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，紫外分光光度计检测蛋白浓度；
11. 将蛋白分装置于-80℃保存。

注意事项

1.跑胶之后的一些注意事项：

a) 胶跑完之后的玻璃板一定要洗干净，而且不要沾到一块，凝固之后很难分离下来，分开放置。

b) 放30%聚丙烯酰胺的那成冰箱最好不要放其他东西。

c) 配完胶的地方清理赶紧。

2. 下面我列举一些从实验手册里总结出来的一部分Tips，仅供参考：

A. 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：NH4，甘氨酸，精氨酸等等；
B. 各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，EGTA，等等；
C. 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，比如DTT，防止二价Ni被还原；
D. 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失；
E. 在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比如0.1-1mM的PMSF，防止目的蛋白被降解（也可以不加，一般是不会发生降解的）；

F. 缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达50%（v/v）
G. 应避免含碳酸氢钠，柠檬酸等物质；
H. 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间；
I. 可加入变性剂促溶，盐酸胍（最高可6M），尿素（最高可8M）以及SKL等
J.可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween，NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染。

1、 关于表达不出来的原因有很多

A.那就是先查查表达外源片段中含有什么内切酶位点，不要设计重了，否则酶切时发现怎么老是有预期外的小片段出现。

B.如果载体上有ATG可以不另外加了，但是通常ATG后不是紧跟外源片段的，如果中间含有载体序列，务必确定中间这段序列不会造成你外源序列的移码。按情况需要，可以加1到2个碱基在引物中使读码框正确。有始有终，同样正常的终止密码子才能保证蛋白的产出。大部分载体也有终止密码子，如果你对载体的不放心，也可以在引物中设计上终止密码子，这样万无一失。

C.看看是否有移码的情况出现，看看稀有密码子情况，因为有时你的目的蛋白表达丰度过低，SDS-PAGE检测不到可以用亲和层析等办法富集你的目的蛋白，然后再跑胶。

D.. 由于大肠杆菌中表达的重组蛋白质缺少哺乳动物细胞特异的翻译后加工，所以，其生物活性无法与天然蛋白质相提并论。

6.提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是优化IPTG浓度与温度，IPTG浓度0.2-0.5mM （可以做个梯度从0.1,0.2,0.4,0.8,1,1.5,2）IPTG足够了，不会降低表达量，反而会增加蛋白的可溶性。IPTG浓度过高，易使蛋白表达速度增大，来不及正确折叠而产生不溶性蛋白（包涵体）。温度：一般37℃诱导3-4小时，30℃诱导6小时是蛋白表达的最大产量期。22℃、18℃、16℃等低温诱导时间在12h-48h。低温诱导可使蛋白缓慢合成，利于蛋白正确折叠形成可溶性蛋白。为了得到更多的可溶性蛋白，可以考虑将温度再降（但表达总量会有所降低），可以考虑25℃，诱导8-10个小时；20℃诱导14-18个小时；甚至15℃24-36小时诱导。

7.重组质粒和菌株的保存建议
在实验室里保存重组菌株的时候，为了挑菌和传代方便，我们常用LB平板保存在4℃冰箱中，需要提质粒和表达接种的时候，就直接从平板上挑菌，但是这种方法对于重组质粒的稳定性不利，容易出现质粒丢失、表达水平不稳定、菌株退化乃至发生污染等情况。 我们建议：
A. 长期存放菌株和pET重组子应该存在甘油－70℃保种。但是要注意高浓度甘油(> 10%)会导致质粒不稳定。请尽量保持甘油浓度8％。（15%浓度的甘油保种液和新鲜菌液1:1就行）     
 B.重组质粒不宜长期保存于表达菌株（带DE3的大肠杆菌）中，请尽量使用带有recA endA突变的克隆菌株（比如C600，DH5a）进行质粒抽提和保存质粒。表达型的菌株提质粒经常会有质量不高或者背景的问题。

8.蛋白表达出来了，但是跑SDS-PAGE时大小不符？

进行SDS-PAGE的时候蛋白的净电荷会影响迁移率。带电量高的蛋白会结合较少的SDS，因此阻碍了蛋白的泳动。富含脯氨酸的蛋白会在SDS-PAGE胶中移动得特别慢。如果蛋白的等电点在5到9之间，并且组成的氨基酸组分没有明显的偏好，那么目的蛋白迁移率与预期相差较远就很有可能不是由于凝胶电泳造成的。我们前面提到过，在很特殊的情况下稀有密码子的问题也会造成表达产物的截短，应加以考虑。可能会相差10kDa左右

9.本实验室的优化步骤：

如果在37℃表达且是上清的话，只需优化一下IPTG的浓度以及诱导时间。如果是包涵体的话，但是需要在上清中表达提高活性的话，可以换载体，例如：PGEX-KG能更好的以可溶形式表达蛋白;还可以通过低温诱导，例如：18℃诱导过夜，而且IPTG浓度要降低（因为对菌体细胞有毒性影响，诱导时间长影响蛋白表达量），可以在5mlLB中加入1.5微升IPTG，以此相对应的浓度计算，确定它是否可以以可溶性的形式表达，然后再优化IPTG浓度以及诱导时间,一般是8h，12h，16h，20h，24h，IPTG浓度可以从0.05mM,0.1mM,0.25mM,0.5mM,1mM,2mM,做梯度，以此摸索条件提高表达量。