非变性质谱技术在蛋白质分析中的应用第二期

张晓夕 赛默飞世尔 大分子应用工程师

①非变性质谱为何适用于蛋白复合物研究？

正如之前所讲，非变性质谱的特点在于：通过在中性的温和条件下进行样品电离与分析，能够避免样品在常规低pH、高有机相条件下发生的变性，从而能够保持样品中较弱的非共价力结合；另外，非变性质谱的溶剂条件更接近生理状态，这对于生物体系中的弱相互作用研究而言，无疑是更为有利的；同时，非变性状态下样品带电数减少，相邻电荷态之间的重叠度下降，有利于复杂组分的解析（图1）。

图1 同一样品在非变性条件（左）与变性条件（右）下进行分子量测定谱图对比

②应用实例

目前，已经有许多课题组使用非变性质谱技术，对蛋白复合物、抗原-抗体结合以及蛋白混合物等进行了研究。Rose等研究了非变性条件下多种蛋白复合物，如Bacteriophage HK97 Capsid五/六聚体、Yeast 20S Proteasome和E. coli GroEL等（图2）；基于Orbitrap平台的高分辨率与高灵敏度，即使是分子量高达801kDa的E. coli GroEL，也能精确地监控其结合了不同数目ADP/ATP的不同形式，提供了一种在非变性状态下研究小分子与生物大分子结合的手段（图3）。

图2 使用Orbitrap超高分辨质谱在非变性条件下对不同样品进行完整分子量测定

图3 使用Orbitrap质谱平台监控小分子与生物大分子结合情况。 未结合小分子的70+ GroEL(黑) ;与ADP共孵育的70+ GroEL(红)；与ATP共孵育的70+ GroEL ATP (蓝)。高分辨率准确计算小分子(ATP or ADP + Na+, Δm/z 6.4 or 7.6 Th)结合数目成为可能。

当研究抗原-抗体相互作用时，同样也会在接近生理状态的非变性质谱条件下进行。Heck等基于非变性质谱技术对tocilizumab与其抗原IL-6的相互作用进行了研究，可观察到结合了不同数目IL-6的tocilizumab原始谱图（图4）。

图4 Orbitrap采集的抗体-抗原复合物非变性质谱图。将抗IL-6抗体与IL6抗原共同孵育后以高分辨质谱检测，可清楚观察到电荷态分离完全的三簇峰，分别为：unbound mAb (red circles, 147.639.2 Da), mAb–IL6 (blue circles, 168.547.5 Da), and mAb–(IL6)2 (green circles,189.452.8 Da)。插图: m/z 5890–5950部分局部放大, 可见质量相近的不同糖型之间也得到分离。

众所周知，Orbitrap质谱平台的一个突出优点即为其高分辨率。当待分析体系中组分较为复杂时，使用高分辨率，可以将不同组分之间精确分离，进而得到准确的测量结果。Thompson等分别使用Q-TOF和Orbitrap对单克隆抗体生产过程中得到的抗体混合物进行了研究，发现对于十几种单抗、分子量仅相差20Da的高度相似混合体系，Orbitrap仍然能够凭借其分辨率的优势，将各组分精确分离，其结果明显优于Q-TOF（图5）。

图5 Orbitrap的高分辨率有利于复杂组分之间的相互分离

在相对定量方面，Orbitrap同样具有出色表现。如图6所示，对于6种单克隆抗体的混合体系，即使在未脱糖的高度复杂情况下，仍能准确地对各种单抗进行相对定量。

图6 使用Orbitrap在非变性条件下对六种单克隆抗体进行相对定量。A,脱糖后进行相对定量；B, 未脱糖直接进行相对定量。

Orbitrap平台的另一突出优点为高稳定性。下表展示了在非变性条件下，对于15种单抗的混合物进行分子量测定的结果，可见三针技术重复之间各抗体相对含量比的相对偏差均小于1.2%，证明Orbitrap质谱平台优异的稳定性，可用于日常生产与研究中。

表1 15种单抗混合物分子量及相对含量理论值与实测值对比

③结语

在这两周的稿件中，我们介绍了非变性质谱技术的原理、特点及其应用实例。非变性质谱技术由于其独特优点，正在被越来越多的应用于生物制药、结构生物学等应用领域中；而Orbitrap质谱平台由于其高分辨率、高灵敏度、高质量精度及高稳定性等优点，用于非变性质谱研究亦有出色表现。如需更多内容，欢迎联系小编，我们下期再见~

参考文献

[1] Native Intact Mass Determination of Antibodies Conjugated with Monomethyl Auristatin E and F at Interchain Cysteine Residues. Anal. Chem. 2012, 84, 2843−2849.

[2] High-sensitivity Orbitrap mass analysis of intact macromolecular assemblies. Nature Methods. 2012, VOL.9 NO.11, 1084-1088.

[3] Exploring an Orbitrap Analyzer for the Characterization of Intact Antibodies by Native Mass Spectrometry. Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 12992 –12996

[4] Complex mixtures of antibodies generated from a single production qualitatively and quantitatively evaluated by native orbitrap mass spectrometry. mabs 6:1, 1–7; January/February 2014.