糖化血红蛋白标准化和检测准确度现状

摘要：糖化血红蛋白 A1c（HbA1c）是诊断糖尿病和监测其治疗效果的重要指标。在国际临床化学与检验医学联合会（IFCC）定义了 HbA1c的被测量之后，经过各方的努力，全球各临床实验室 HbA1c检测结果间的差异正逐步减小。所有提供 HbA1c检测产品的厂商都不会客观地描述自己产品的弱点，只会强调其优点和临床价值。面对 HbA1c检测的现状，临床实验室必须充分了解每个产品的特性及其不足之处，在将产品用于临床检测前必须验证产品的分析性能。只有确认其分析性能能够用于临床检测时，才能使用。一个实验室内必须具备 2 种不同检测方法的产品，这样才能识别患者样品内有无异常血红蛋白。目前，尽管人们认为免疫学方法检测 HbA1c时无异常血红蛋白的干扰，但国际上尚未从临床上对各种异常血红蛋白的影响作出客观的判断。为了患者的利益，临床实验室一定要充分了解更多的信息。

1968年，学者RANBAR等从糖尿病患者红细胞中发现了异常血红蛋白。2012年， 糖尿病协会（American Diabetes Association， ADA）给他颁发了杰出发现奖。然而，就在这一年 ，Ranbar博士去世了。 如果当年不是Ranbar 等在糖尿病患者中发现了糖化血红蛋白， 如今的糖尿病研究究竟发展到哪一步还是个未知数。

一、明确糖化血红蛋白在糖尿病治疗和糖尿病并发症监测中具有重要价值

（ 一 ）糖尿病控制与并发症研究（ the Diabetes Control and Complications Trial，DCCT）

20 世纪80年代，糖尿病及其并发症对患者 的不利影响受到了卫生和公共服务部（theUnited States Department of Health and Human Services，HHS）的高度重视。1983 年，由 HHS、卫生研究院（the National Institutes of Health，NIH）下属糖尿病、消化病、肾病研 究院共同参与并开展了为期9年的 DCCT试验。 为了使DCCT得到明确的成果，研究者决定使用糖化血红蛋白作为观察病情控制或并发症的重要指标。面对当时市场上糖化血红蛋白检测试剂混乱的情况，DCCT的专家们要求在各地开展这项研究中所有涉及到的1型糖尿病患者的血液标本全部送往2个实验室（密苏里大学实 验室和明尼苏达大学实验室）检测，并且指定密苏里大学实验室为唯一的比较实验室。该实验室检测糖化血红蛋白的方法为阳离子选择高效液相层析法，仪器由 Bio-Rad公司生产；明尼苏达大学实验室也使用 Bio-Rad 公司相同型号的仪器，但必须按照密苏里大学实验室的样品结果予以校准。在当时既无参考物质又无参考方法的情况下，以人为指定的方式使检测结果具有可比性是有效的手段。以百分值报告糖化血红蛋白结果，确定糖化血红蛋白结果的参考区间上限为 6.0%，糖化血红蛋白 >7.0%的患者必须接受治疗就是 DCCT的研究成果 。如果要将 DCCT的研究成果用于临床，为糖尿病患者服务，就必须使各临床实验室的糖化血红蛋白结果和DCCT 的糖化血红蛋白结果具有可比性。如果仅确定各检测方法得出的糖化血红蛋白测定值是否在实验室的“正常范围”内是没有临床价值的。各临床实验室需要更精确地了解这个检测值与 DCCT 检测值的关系是什么？因为只有DCCT 结果直接与平均血糖及临床后果的危险性相关。

（ 二 ）英 国 前 瞻 性 糖 尿 病 研 究（ U . K . Prospective Diabetes Study，UKPDS）

1998 年，UKPDS 发表了临床试验结果。他们对2型糖尿病患者进行了10年的研究，重复了DCCT的发现，即糖尿病患者并发症的减少与糖化血红蛋白降低有关。UKPDS 使用了国家糖化血红蛋白标准化计划（the National GlycohemoglobinStandardization Program，NGSP）认可的糖化血红蛋白测定方法。另外，他们还通过与 NGSP参考网络进行比对来确保DCCT和UKPDS检测结果的可比性。由此可见，DCCT和UKPDS 的糖化血红蛋白结果都可以用于1型或 2 型糖尿病患者，预计未来还可用于预测糖尿病患者个人的并发症危险度。

二、什么是糖化血红蛋白（即什么是 HbA1c的被测量）

糖化蛋白是食品行业评价烘烤的面包点心的一个重要指标。刚刚出炉的面包上闻到的香味以及在面包上看到的略带焦黄的颜色，这些都是面包中的糖分与蛋白在烘烤过程中蛋白被糖化后的表现。人体从食物中摄入淀粉和糖分，在胃肠道内被淀粉酶迅速分解为单个葡萄糖，由胃肠道吸收，然后进入肝脏，形成肝糖原储存于体内。因此，人体进食后血液中葡萄糖浓度会升高。此时，人体的内分泌激素，尤其是胰岛素会大量分泌，促使葡萄糖快速从血液中进入肝脏。 如果我们不注意有规律地饮食，吃得过多，增加了摄入的葡萄糖量，使大量葡萄糖淤积于血液， 导致血液中葡萄糖浓度明显升高，为了减轻血液内的负担，这些葡萄糖只能通过肾脏排出体外。 长此以往，最终形成糖尿病。

 

由于血液中葡萄糖浓度升高，使血液中所有的蛋白质和代谢物均被高浓度葡萄糖包围。葡萄糖与蛋白质的紧密接触促使葡萄糖吸附在蛋白质上。在蛋白质结构的游离氨基处，先吸附葡萄糖，然后发生缓慢的分子重新排列，最终形成稳定的糖化蛋白。因此，血液中凡是具有游离氨基的蛋白质都会被糖化。但血液中许多蛋白质的存在时间或半衰期较短，所以被糖化的蛋白质的量不是很大。其中白蛋白的半衰期为1个月左右，检测糖化白蛋白可以大致反映患者近 1个月内的血糖控制情况。

       

红细胞是血液中生存时间最长的一个有形成分，其半衰期可达3个月。血液中高浓度的葡萄糖不仅“糖化”了红细胞膜，还透过红细胞膜进入细胞浆内，“糖化”血红蛋白。在血红蛋白的每个珠蛋白长链上都有多个游离氨基，当血红蛋白与葡萄糖长期共存后会逐渐成为“糖化血红蛋白”。检测血液中红细胞内血红蛋白的糖化比例 可以反映糖尿病患者约3个月内的血糖控制情况。

        

20 世纪70年代，当研究者们了解了血红蛋白被糖化的情况后，第1个被用于临床实验室检测的项目是果糖胺。葡萄糖被蛋白游离氨基吸附并经分子重排后形成了血红蛋白分子上酮胺结构——1- 脱氧果糖基。该基团具有氧化还原性质，可用于实验室检测。但由于无标准物质， 所以不同方法间难以具有可比性。

        

早在1955年，研究者们就注意到成年人血红蛋白为非均相。1958 年，Allen 发现采用离子交换层析法分离人血红蛋白，其可被分离出3个小的组分，它们较血红蛋白 A（hemoglobin A，HbA）的负电荷更强。这3个血红蛋白组分被命名为HbA1a、HbA1b、HbA1c。但是，Allen 并没有认识到其与糖尿病的关系。直至 Ranbar使用琼脂电泳发现这些小血红蛋白组分在糖尿病患者血液中明显升高，它们与糖尿病的关联才被人们所认识。20 世纪70 年代中期，科学家们发现是葡萄糖对HbA 的非遗传修饰产生了 HbA1c。 HbA1c 与空腹葡萄糖、葡萄糖耐量试验中的葡萄糖峰值及受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线下面积、以往数个星 期的平均葡萄糖水平等均有关联。1980年，检测笼统的糖化血红蛋白的项目在临床上被广泛应用，但当时糖化血红蛋白结果的可比性很差。 当前，人们已经清楚地认识到：天然（非糖化）的血红蛋白是 HbA0（2α2β 链），血红蛋白 β 链 N-末端缬氨酸的游离氨基及其他游离氨基（α 链 N-末端缬氨酸、赖氨酸 ε-氨基）可与不同的碳水 化合物糖基化形成糖化亚组分（HbA1a1、HbA1a2、 HbA1b 和 HbA1c）。 所有这些糖化亚组分被称为总糖化血红蛋白（即HbA1）。少量的胎儿血红蛋白 [fetal hemoglobin，HbF（2α2γ 链）] 和 HbA2（2α2δ 链）γ 链或 δ 链N-末端缬氨酸以类似的方式被糖基化，形成 HbA2c。因此，如今叙述的糖化血红蛋白其实指的是 HbA1c。由于每个患者的血红蛋白浓度不同，所以，HbA1c量的表示方式以占总血红蛋白量的百分比更为合理。即 HbA1c（%）=HbA1c/HbA×100。

 三、NGSP的HbA1c标准化

        

1993年 ，在 DCCT 结果公布前 ，美 国临床化学协会（American Association for Clinical Chemistry，AACC）成立了 HbA1c标准化委员会。该委员会的任务是实现各实验室 HbA1c的可比性。 AACC肯定了实现HbA1c检测国际可比性的重要性。由于欧洲各国在 HbA1c的可比性和室间质评方面有着丰富的经验，因此HbA1c标准化委员会还包括了欧洲各国的成员。 HbA1c标准化委员会围绕 DCCT参考实验室建立了可比性方案。该方案在1995 年被厂商的协调委员会认可。1996年，HbA1c标准化委员会解散，被 NGSP 替代（NGSP 是由疾病控制中心负责的一个行政管理机构）。NGSP 在1996年7月开始工作。1997年，NGSP被ADA认可。从1996 年开始，控制糖尿病成为的政府行为。

（一）NGSP 标准化的做法 

        

NGSP实现标准化过程有3个主要步骤， 其样品均为新鲜全血。

第1步是对厂商的测定方法进行校准，使厂商实验室的 HbA1c结果和 NGSP网络的实验室结果具有可比性；

第2步是由厂商确认他们的产品也与 NGSP网络的实验室结果具有可比性；

第3步是各临床实验室参加室间质评，检测由NGSP网络实验室定值的新鲜全血样品，以验证他们日常报告的结果的可比性。严格来说，全世界的临床实验室只有得到NGSP的认可，才有资格报告以百分值表示的 HbA1c结果。

（二）ADA的建议

        

实验室只使用被 NGSP认可的 HbA1c检测方法，其提供的 HbA1c结果与DCCT结果具有可比性，可以使用由DCCT 建立的参考区间。临床实验室自身也必须被 NGSP 认可，才有资格报告符合 NGSP要求的结果（百分值）。在使用被 NGSP认可的产品时，临床实验室检测 NGSP 新鲜全血样品的结果应符合检测性能要求，即方法应具有良好的重现性，其总不精密度须低于指定水平。

（ 三 ）NGSP 和 美 国 病 理 学 家 协 会（ t h e College of American Pathologists，CAP）的协调 

        

CAP 提供了全世界最大的 HbA1c 能力比对 试验。NGSP 与 CAP 一起协调，通过 NGSP为CAP GH2 全血能力比对试验样品设定靶值，采纳和逐渐提升以准确度为基础的分级。1996 年， CAP开始使用混合新鲜全血样品进行 GH2 调查。因为混合新鲜全血样品没有以往 HbA1c调查品的基质效应，其结果可以可靠地用于检查方法内和方法间的偏移和不精密度。2010 年，CAP GH2 全血能力比对试验有超过3000 家实验室参与，有许多实验室来自以外。

（四）检测方法性能上的改善

        

从 2000年到2010 年的 10年间，所有方法检测 HbA1c 低浓度样品（4%～6%HbA1c）的变异系数（coefficient of variation，CV）从 7.0% 下降到 4.0%；对于 6%～10%HbA1c 的样品，所有方法的 CV 从 5.0%～5.5% 下降到 4.0%。目前，许多方法的实验室间 CV ≤ 3.0%，少数方法已达到≤ 2.0%。CAP要求 2011年后各实验室检测 HbA1c 的 CV 为 7.0%。

（五）CAP 的 HbA1c 分析目标 

        

临床医生在使用 HbA1c 评估糖尿病患者的血糖状态时经常需考虑患者的血糖控制是稳定、是改善还是控制不佳；还需考虑如何将 HbA1c结果与糖尿病患者个人的目标 HbA1c 进行比较（2014年，ADA 建议糖尿病患者以6%HbA1c 作 为血糖控制目标，若可行则可再低一些）。临床医生可以 0.40%HbA1c 作为“临床上显著变化”的指标[患者必须接受强化治疗的 HbA1c 水平 为7%，而 CAP和NGSP确定的分析目标（即允许误差）为6%，相乘等于0.42% HbA1c，四舍 五入为0.4%HbA1c]，如患者治疗后的 HbA1c在7.0%±0.4%（即 6.6%～7.4%）以内，说明HbA1c结果的变化主要是因检测误差所致，不是患者的病情有所改善。只有当 HbA1c的检测结果 <6.6% 时才可认为患者的治疗是有效的。2014年，在 NGSP 的调查中，低、中、高水平 HbA1c的CV已分别达到 3.8%、3.8% 和 3.4%。因此，CAP建议所有HbA1c检测方法的目标 CV 应保持在≤3.5%。

四、国际临床化学与检验医学联合会（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）的 HbA1c标准化

（一）NGSP 的标准化出现了问题

        

被 DCCT 及NGSP中指定作为比较方法的 Bio-Rex 70 树脂高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）与瑞典推荐的 Mono S HPLC 标准化方法在 HbA1c 判断限水平处的差异高达 20%。日本的临床试验也显示，尽管采用HPLC 检测 HbA1c，但其 HbA1c 检测值低于 NGSP 的值。由此可见， DCCT 参考方法测得的 HbA1c 值并不是真正的、唯一的 HbA1c值。DCCT/NGSP 的标准化只将密苏里大学实验室的 HPLC分离结果作为标准化的唯一依据，没有任何 HbA1c参考物质或确认该物质的参考方法。

（二）IFCC 的糖化血红蛋白标准化

1995年，IFCC 成立了HbA1c 标准化工作组，以建立 HbA1c 检测的国际统一标准。他们建立和确认了2 个侯选参考方法，同时制备了HbA1c、HbA0（非糖化血红蛋白）参考物质，并以此作为全球可比性分析的基础。

1、确定HbA1c 被测量首先，IFCC确定了HbA1c 被测量 。IFCC命名、属性和单位委员会（the Committee on Nomenclature，Properties and Units，C-NPU）批准了以往被称为“HbA1c”的参考测量程序（方法）。该程序测定的是单一分子 属性，其检测结果为“物质组分的量（mol）”，而不是质量（重量）（kg）。在计量上可溯源至国际单位制（international system of units，SI）。IFCC C-NPU 认为：在所有有 β 链的血红蛋白中，β 链 N-纈氨酰 -1- 果糖基血红蛋白可被 IFCC参考测量程序特异地测量，所以在计量单位上可溯源 至“mmol/mol”。因此，IFCC 的参考测量程序检测的被测量非常明确，检测的非糖化血红蛋白为 β 链血红蛋白（HbA0）；检测的糖化血红蛋白为 β 链 N-纈氨酰 -1-果糖基血红蛋白 [HbA1c，即 β-（N- 脱氧果糖基）血红蛋白 ]。以往不规范的用语和测量（检测）单位：原 IFCC- 国际理论和应 用化学联合会（the International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）的命名、属性和单位（nomenclature，properties and units，NPU）数据 库有“HbA1c”专用的属性类词语，该被测量的代 码为 NPU03835，命名的是血红蛋白（Fe；全血） 和血红蛋白 A1c（Fe），为物质的组分；其计量单位被假设为“1”。

2 、IFCC 的 HbA1c 参考测量系统 2002 年，IFCC 批准了检测人全血 HbA1c 的 2 个参考方法[高效液相色谱 - 电喷雾质谱（high performance liquid chromatography-electrospray ionization/ mass spectrometry，HPLC-ESI/MS）与高效液相色谱 - 毛细管电泳（high performance liquid chromatography-capillary  electrophoresis，HPLC-CE）]。这2种参考方法依据对血红蛋白 β 链 N 端的特定检测，能得到一致的结果。其基本原理是以胞内蛋白内切酶Glu-C 水解完整的血红蛋白分子，得到 HbA1c和HbA0的 β 链 N 端的六肽多肽。这些多肽以反相 HPLC 分离，并由电喷射离子化 - 质谱或由毛细管电泳进行定量。以水解得到多肽和联用分离技术克服了以往使用的 HbA1c分离系统分辨率不足的缺点。2007 年， 欧洲参考物质和参考测量研究院（the Institute for Reference Materials and Measurements，IRMM）批准并发布了 IRMM/IFCC-466 号参考物质 。该 参考物质为人全血分离的血红蛋白，内含非糖化的 HbA0 和糖化的HbA1c。该参考物质给出了 HbA1c/（HbA0 + HbA1c）值（mmol/mol）。在 IFCC参考实验室和现有的指定比较方法（designated compared method，DCM）（如 NGSP）间实施了多次比较研究。研究结果显示，IFCC 参考实验室的 HbA1c结果与不同的 DCM 之间的回归等式（一级等式）的关系是稳定的。以新鲜和冰冻全血组成了二级参考物质。将这些二级参考物 质分发给厂商和实施 DCM 的实验室，使其方法溯源至 IFCC参考系统。目前，随着新技术的不断发展，定期更新、重新确定参考检测程序非常重要。

五、实现国际 HbA1c标准化

        

2004 年 ，ADA 、欧 洲 糖 尿 病 研 究 学 会（European Association for the Study of Diabetes， EASD）、国际糖尿病学会（ the International Diabetes Federation，IDF）3 大国际组织达成共识，对全球报告 HbA1c 结果具有可比性无异议。 ADA、EASD 和 IDF共同成立了 HbA1c工作组，目的是使全球HbA1c 报告一致。目前可以立即实施的有：

（1）确定 IFCC参考方法是唯一能满足标准化要求的方法，将其作为厂商校准 HbA1c检测系统的新的全球标准；

（2）在现有的国际实验室网络内使用新的IFCC方法学被确定为“国际证实过程”；

（3）厂商无需改变现有的报告方式，直至完成以后的工作（即证实 IFCC HbA1c值在临床上的应用价值），目前继续使用DCCT/ UKPDS 值；

（4）要求 IFCC对2型糖尿病患者进行类似DCCT的临床试验，确认IFCCHbA1c值在临床上的使用价值。

        

2007年5月4日，ADA、EASD、IDF和IFCC在意大利米兰召开会议。会后发表了联合声明，基本内容如下：

（1）HbA检测结果应全球标准化，包括参考系统和结果报告。

（2）IFCC参考系统是唯一有效的实施检测标准化的基础。

（3）全球报告的HbA1c结果为 IFCC 单位（mmol/mol）和使用 IFCC-NGSP 一级等式推导出的NGSP单位（%）[NGSP（%）=（0.091 5 × IFCC）+2.15]。

（ 4 ）如 果继续进行 的“ 平均血浆葡萄糖研究”满足其先前 / 特定的指标，由HbA1c导出的平均葡萄糖 值 HbA1c derived average glucose，ADAG）可由HbA1c结果计算而来，也可作为解释 HbA1c结果的报告。

（5）在 临床导则中出现的血糖目标应表达为 IFCC单 位、推导出的NGSP 单位和 ADAG。

        

所有组织均同意这个联合声明的提议，建议尽快在全球实施。这个联合声明将进一步为HbA1c的检测、全球 HbA1c结果的可比性和HbA1c生物化学特性分析作出贡献。以科学、正确的单位表达检测结果，并在临床上解释有关结果是常见的做法（如肌酐和估算肾小球滤过率）。最后， 临床医生将有机会对处于治疗中的患者以最合适的词语和单位来表达慢性糖血症的概念。

HbA1c的国际标准化是一个重大的决定，第1次对什么是 HbA1c作出了明确的定义，为全球 HbA1c的可比性建立了牢固的基础。但是，任何事物总有不足之处。HbA1c标准化在推广应用后，出现了声明可溯源至 IFCC参考系统的免疫学检测方法和酶法，其结果与 NGSP 的 HPLC方法具有明显的差异。（未完待续）

作者：上海市临床检验中心  冯仁丰  

参考文献：略

文章来源：检验医学2016年5月第31卷第五期

明德生物糖化血红蛋白（HbA1c）产品简介

【产品名称】：糖化血红蛋白（HbA1c）检测试剂盒（免疫层析法）

【产品分型】：全血型

【产品规格】：2Test/盒，20Test/盒，40Test/盒，50Test/盒

【注册证号】：鄂食药监械（准）字2013第2401852号（更）

【预期用途】：糖化血红蛋白（HbA1c）检测试剂盒是应用免疫层析技术，通过免疫定量分析仪判读，建立的快速、特异、简便的定量检测试剂盒。其定量检测人血液中的糖化血红蛋白（HbA1c），主要用于临床医生的辅助诊断。

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2. 再谈糖化血红蛋白 （HbA1c）

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