实验技巧 | 开启RNA和蛋白表达水平平行分析的大门 — SingleShot 细胞裂解试剂盒

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在基因表达水平的研究中，往往需要从转录及翻译的水平来对其进行综合的评估。传统的实验方法，需要两组相同处理的实验组，一组样本用于进行RNA的提取用于 RT-Qpcr实验;另一组用于蛋白的提取用于Western Blot。这种方法需要消耗较大的人力和精力在样本裂解和靶标分子的提取上，不适合于进行大量样本以及珍贵样本来源的检测。

在此，小编为大家奉上一种可以同时裂解提取细胞中的RNA与蛋白的方法 — SingleShot™ 细胞裂解液，该试剂盒可与RT-qPCR及Western Blot完美兼容。下游的Western Blot 流程中采用免染胶技术进一步改进，使用总蛋白作为内参标准化，省略了传统的总蛋白定量的方法。

下面就跟随小编来浏览一下这个实验的流程吧： 

图1. 实验流程  5 x 10³ NTera 2 (NT2) 细胞培养于 96 孔板中，分别以维甲酸(RA)及空白对照连续培养4天，加入30 µl  SingleShot裂解缓冲液。(1) 5 µl 裂解液用于下游的 RT-qPCR;  (2) 25 µl 裂解液用于下游的Western  Blot。

结果

NT2细胞分化期间三种转录因子的RNA和蛋白质表达的变化

图2. RA处理后对NANOG, OCT4A, HOXB3基因表达的影响. A, 蛋白表达分析，经过RA刺激后，NANOG, OCT4A,  HOXB3蛋白水平经总蛋白标准化后，与对照组相比下降50-90%。B, 转录水平分析， NANOG 与 OCT4A基因与对照组相比降低了 90% ，而HOXB3基因却上调了近17倍。

那么问题就来了：SingleShot™流程中如何对上样总蛋白进行定量？

解决方法就是免染胶技术+总蛋白标准化

在我们熟知的Western Blot流程中，提取蛋白后第一步需要做的是对总蛋白进行定量，后续根据上样需求对上样量进行一个均一化操作，再以其中的某个管家蛋白作为内参蛋白。但是这种方法存在着许多的问题，最近科学家们开始采用总蛋白来进行标准化以取代原来的单一管家蛋白标准化（Aldridge et al. 2008, Gilda and Gomes 2013, Vigelsø et al. 2015）免染胶技术技术提供了一种直观的和定量总蛋白质的方法，同时也提供了一种有效的标准化方法 (Posch et al. 2013)。

根据以往的实验经验，我们知道仅仅一个孔（96孔板）的细胞量是无法同时满足RT-qPCR和Western Blot的实验要求的。采用SingleShot™细胞裂解试剂盒，可以省去从基因组中分离纯化RNA以及蛋白的操作步骤，简化实验步骤的同时，提高了检测的灵敏度。免染胶技术和总蛋白标准化也免去了上样前总蛋白定量的操作。本实验流程对于进行原代细胞研究的实验室非常有用，通过减少每组样本所需要的细胞数，研究者还可以观察到更高水平的复制，潜在地产生更具统计意义和有意义的实验结果。 

以上是小编为大家展示的利用SingleShot™实验流程对NT2细胞中三种转录因子在RNA及蛋白水平的平行检测。同样，该实验方案还可用于其他的候选生物标志物或转录因子的检测。

参考文献：

Aldridge GM et al. (2008). The use of total protein stains as loading controls: an alternative to high-abundance single-protein controls in semi-quantitative immunoblotting. J Neurosci Methods 172, 250–254.

Gilda JE and Gomes AV (2013). Stain-free total protein staining is a superior loading control to β-actin for western blots. Anal Biochem 440, 186–188.

Vigelsø A et al. (2015). GAPDH and β-actin protein decreases with aging, making stain-free technology a superior loading control in western blotting of human skeletal muscle. J Appl Physiol (1985) 118, 386–394.

Warsow G et al. (2013). Differential network analysis applied to preoperative breast cancer chemotherapy response. PLoS One 8, e81784.