ProteinSimple生物制药工艺开发电子书(四)-蛋白表征

 抗体类药物及重组蛋白类药物，因为均为大分子药物，且修饰复杂，质量控制难度大，因而国内外专家均提出质量源于设计(QbD)的理念。认为药物质量应该在基于对药物分子生物学特性，作用机制全面了解的前提下，设计开发相应的生产工艺以求药物分子达到其预期的质量属性，因而抗体类生物治疗药物的关键质量属性（CQA）设定尤其重要。

Maurice iCIEF、CE-SDS双功能分析系统

Maurice是ProteinSimple在iCE280,iCE3,之后开发的第三代iCE系列产品，坚持采用了ProteinSimple首创的成像毛细管等电聚焦电泳（iCIEF），同时增加了CE-SDS检测。

成像毛细管等电聚焦电泳iCIEF

研究单克隆抗体电荷异质性的常规方法分别包括平板等点聚焦（isoelectric focusing，IEF）和离子色谱，前者分辨率较差。近年来由于全景成像毛细管等电聚焦电泳（imaged capillary isoElectric focusing， iCIEF）的高分辨率、自动化、重复性好、实验条件优化较易的优点，2012年来自于北美欧洲11个生物制药巨头（SeattleGenetics，Bristol Myers Squibb，Amgen，Baxter，Biogen Idec，Eli Lilly，Genentech，Genzyme, Johnson and Johnson，Pfizer, Solvias，Roche,）的12个不同实验室，进行了iCIEF实验室间数据比较，同一样本，在不同实验室，使用不同仪器和毛细管，其apparent pI RSD小于0.8%。

iCE3和Maurice系统是等电点和电荷异质性分析的金标准。

ADC药物分析

Determination of Charge Heterogeneity andLevel of Unconjugated Antibody by Imaged cIEF. Antibody-Drug Conjugates, Methods in Molecular Biology, vol. 1045

高唾液酸化Fc融合蛋白检测

Applications of imaged capillaryisoelectric focussing technique in development of biopharmaceuticalglycoprotein-based products. Electrophoresis2012, 33, 1538–1544 Department of Bioprocess and Bioanalytical Research,Merck esearch Laboratories, West Point, PA, USA

重组HBsAg疫苗

Maurice全自动蛋白质CE-SDS分析系统

全自动Simple Western系统 

从1979年Roche科学家发明三明治夹心转膜，1981年美国著名的西雅图弗雷德·哈金森癌症研究中心正式命名WesternBlot，在过去三十几年里，Western Blot已经被广泛应用各种蛋白质研究，在生物制药领域也有广发应用，比如生物标志物发现，治疗性蛋白药物开发，单抗药物鉴别，疫苗抗原筛选，抗体筛选等。   

Western Blot技术在过去三十多年里基本没有明显的发展，一直需要研究人员花费大量操作四件。美国ProteinSimple基于毛细管电泳技术，开发出1小时手工操作，3小时完成WesternBlot全程定量检测，彻底革新了Western Blot技术。SimpleWestern系统拥有一系列专利：US7，935，308B2；US7，935，479B2；US7，935，489B2等。

Simple Western技术突破：

• 自动灌胶，跑胶，无需转膜，解决了影响Western Blot结果的两个重要瓶颈

• 根据化学发光信号值进行定量，解决了Western Blot不能准确定量的问题

• 无需值守，全程自动检测，解决了Western Blot大量时间耗费

• 400nl毛细管，微量样品检测，解决了稀缺样品无法进行Western Blot检测现状

• 覆盖2-440KD分子量范围，解决大分子量和小分子量蛋白的检测瓶颈 

 

Simple Western 系统的高重复性 

生物药品的免疫学检测，比研究领域内对重复性，稳定性的要求更高。因此Merck疫苗在其实验室对Simple Western重复性，稳定性进行评价。三个样品，五次检测，CV＜10%，传统westernblot 的CV则>35%。

Qualitative andquantitative evaluation of Simon^TM, a new CE-based automated Westernblot system as applied to vaccine development.Electrophoresis 2012, 33,2790–2797 

免疫学鉴定 

在生物医药研发中，比如疫苗候选抗原筛选，抗原鉴定，自身免疫抗体谱检测中膜条包被抗原，抗体药物免疫原等，免疫学检测都是非常重要的方法。

WHO推荐对单价，多价疫苗均需进行抗原鉴定。核磁共振是非偶联多糖疫苗鉴定的金标准，但是对于偶联蛋白载体的疫苗不能很好工作，之前ELISA和传统western blot是主要检测手段。但是这两种手段均费时，费力，重复性差。高通量全自动Simple Western可以解决这些问题。单次检测只需3-4小时，自动化避免手工操作引起的重复性差的问题。Merck疫苗使用Peggy Sue高通量系统，建立15价肺炎链球菌疫苗抗原鉴定方法，可以同时检测15个血清型肺炎链球菌抗原。

Automatedcapillary Western dot blot method for the identity of a 15-valent pneumococcalconjugate vaccine，Analytical Biochemistry xxx (2015)

Ella 全自动微流控ELISA系统 --90分钟获得372个ELISA数据

1小时完成72样本HCP检测

宿主细胞蛋白残留(HCP)可能会引起机体过敏，同时HCP残留量也可以反应整个生产工艺，因而是生物工艺关键质量属性的重点监测项目。传统ELISA法，步骤繁琐，人为引入误差大，时间长，效率低。 ELLA1小时可以进行72样本HCP检测，全程自动完实现检测标准化，降低CV值

生物制药巨头Genentech公司评估Ella系统，对8个因子高中低三种QC样品，进行检测，结果精准稳定。intra-assay CV集中在3-6%， inter-assay CV集中在6-8%，显著优于其他方法。

Bioanalyticalqualification of clinical biomarker assays in plasma using a novelmulti-analyte Simple Plex^™ platform. Bioanalysis(2016) 8(23), 2415–2428

2016年11月份,Cell杂志封面文章，题目为：Host and Environmental Factors InfluencingIndividual Human Cytokine Response，作者研究个体及环境因素对人体细胞因子表达的影响，以作为功能人类基因组的重要补充。

研究者包括多个世界著名大学及研究机构：荷兰拉德堡德大学医学中心，美国麻省理工学院Broad研究所，美国哈佛大学麻省总医院，美国科罗拉多大学医学院，新加披科技部，挪威奥斯陆大学医院等。

研究对象：534名健康志愿者。

作为最重要的数据：静息状态细胞因子，表达水平低于传统ELISA检测下限，故研究者采用Ella进行数据采集。

 

原文阅读：

Measurement ofresting levels of low abundance cytokines such as IL-1b, IL-6,IL-18, and VEGFare below the lower limit of quantification by standard ELISAs in a healthycohort; therefore, the Ella microfluidic analyzer wasused to assess cytokine concentrations in the fg/mL to low pg/mL range.（Ella）

Host andEnvironmental Factors Influencing Individual Human Cytokine Responses，ter Horst et al., 2016, Cell 167,1111–1124