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Western Blot实验——电泳篇

中源生物 2020-03-22 06:29:04


电泳可以是单相的(即一维分离)也可以是双相的。单相电泳常用来进行蛋白和核酸的分离,蛋白的双相电泳用于指纹-识别(即总蛋白成分分析)和细胞里所有蛋白的精确定位。

这里我们所描述的是单相电泳技术。我们推荐《Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach》(第三版,B. D. Hames 和D. Rickwood 主编,实用方法系列,牛津大学出版社,1998年)这本书作为理解双相电泳的参考。


PAGE 凝胶的制备


聚丙烯酰胺凝胶电泳,英文简称是SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis),是根据蛋白质分子量来分离蛋白质的基本方法。

聚丙烯酰胺凝胶由两种复合物混合而成,丙烯酰胺和N,N-亚甲基丙烯酰胺(简称bis)。Bis 是凝胶的交联剂。通过加入过硫酸铵和DMAP或TEMED 启动交联聚合作用。凝胶是中性,水溶性三维网状结构(通过亚甲基交联的碳氢化合物)。

凝胶对分子的分离取决于凝胶所形成的孔径大小。凝胶孔径的大小由两个因素决定:丙烯酰胺的总量(%T)和交联的数量(%C),当丙烯酰胺的比例升高,孔径降低。5% C 时孔径最小。C% 增加或减少,孔径也随之增大或减少。凝胶以百分比进行设计,并且有二个重要的参数。总丙烯酰胺指的是丙烯酰胺加上bis丙烯酰胺所占的百分比(w/v)。例如,7.5% T 表示100ml 凝胶中有7.5 g 丙烯酰胺和bis。


凝胶可以商业购买或在实验室自己制备(配方可以在实验室手册上找到)。胶凝体的百分比对蛋白质迁移率和分离度至关重要。


TIPS

拇指原则:目标蛋白分子量越小,mono/bis百分比越高;目标蛋白分子量越大,mono/bis的百分比越低。


丙烯酰胺是潜在的有累积作用的神经毒素:操作时要一直佩戴手套。

按照厂家说明将凝胶放在电泳槽中并且浸泡在电泳缓冲液中。

阳性对照


阳性对照裂解物用来表明试验是有效的并且是正确的,及可证明目标蛋白不在样本中表达。

TIPS

当设定一个新实验时,我们强烈推荐使用阳性对照裂解物,这将提高试验的可信度

分子量标准

跑在样品旁边的分子量标准能测定蛋白分子量的大小并且能监测电泳的进展。市面上有许多分子量标准可供选择。

Abcam有下列分子量标准:

货号ab48854 (MW 70, 57, 40, 28, 18, 13.5 and 8.5 kDa)

货号ab115832, Prism Protein Ladder (10-175 kDa)

货号ab116027, Prism Ultra Protein Ladder (10-180 kDa)

货号ab116028, Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)

货号ab116029, Prism Ultra Protein Ladder (3.5-245 kDa)

上样和跑凝胶

使用特定的凝胶上样吸头或微型注射器在狭窄的样品池中加入全部样品,注意不要用尖头刺破池的底部,否则会形成扭曲的条带。

不要过度填充样品池,如果样品溢入旁边的样品池,将会影响结果。

每个样品池装载20-40μg 蛋白。

将凝胶浸泡在电泳缓冲液中,这些缓冲液通常包含SDS,天然的凝胶电泳除外。

一个标准的PAGE 电泳缓冲液,又叫运行(running)缓冲液,是1×氨基乙酸-甘氨酸。

跑凝胶时按照厂家推荐的时间进行,这些可以随着仪器的改变而变更(根据电压,1 小时至过夜)。

当染料分子(“迁移前沿”)到达凝胶的底部,关闭电源。此时蛋白会从凝胶上慢慢的洗脱,因此不要保存在凝胶里,要迅速进行下一步的转移操作。


内参的使用

内参是用来检测凝胶中的泳道是否载有相同的上样量。在比较不同样品的蛋白表达水平时这一点尤其重要。这对检查整个凝胶的平均转膜亦十分重要。如有上样或转膜不平均的情况,内参对照可用来定量每条泳道的蛋白量。对于准备发表出版的试验,加入对照是绝对必需的。



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