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饲料原料中酸溶蛋白的测定方法研究

生物饲料工程研究中心 2019-04-14 16:01:05

导读

发酵、酶解粕类和植物蛋白的主要目的是将其中的大分子蛋白降解成为小分子蛋白,甚至降解成多肽和小肽,从而提高其在动物体内的消化率和机体的免疫力。小分子蛋白含量是评价发酵、酶解粕类蛋白质品质的主要指标之一,而饲料行业常常使用三氯乙酸酸溶蛋白(TCA-N) 作为此类产品中小分子蛋白含量的常规检测方法。研究表明:使用酸溶蛋白含量指标评价发酵、酶解粕类蛋白质品质,既可以反映其中抗原蛋白质和其他蛋白质抗营养因子被水解的程度,进而揭示该类抗营养因子活性被消除的程度,又可一定程度上反映肽含量的高低。

农业部于2012 年6 月1 日发布并于2013 年1月1 日起正式施行的《饲料原料目录》(农业部公告第1773 号,以下简称《目录》)中规定,针对不同的原料进行“强制性标识要求”,并要求“规定的质量要求或卫生特征指标,应在原料标签的分析保证值等项目中列出”。针对部分单一饲料品种,《目录》规定了除对常规的粗蛋白质、粗灰分、水分等指标要进行标识外,同时还规定了“酸溶蛋白”的标识要求。而根据《目录》的通则要求,对于属于单一饲料品种范畴的产品“应当办理生产许可证和进口登记证”,而在办理上述许可文件过程中,均存在对强制性标识项目的控制指标规定和检测的要求,但由于此前没有对“酸溶蛋白”进行强制性标识的要求,多数此类饲料原料的生产企业未给予关注,部分经营者对此指标知之甚少,更谈不上对该项目进行控制指标的规定。基于此类现状,本研究通过查阅相关参考资料,对不同检测方法——过滤法和离心法进行比较研究,最终确定了饲料原料中酸溶蛋白的检测方法,并通过实际样品测定给出部分产品中酸溶蛋白的检测结果,为上述饲料原料生产和经营企业规定酸溶蛋白的控制指标提供参考。

1范围

由表1 可知,《目录》对大米酶解蛋白、玉米酶解蛋白、大豆酶解蛋白、棉籽酶解蛋白等4 种饲料原料除了常规的粗蛋白质、粗灰分和钙含量的标识外,还规定了酸溶蛋白(三氯乙酸可溶蛋白);对发酵豆粕、发酵棉籽蛋白和酿酒酵母发酵白酒糟等3 种饲料原料,除了常规的粗蛋白、水分、粗纤维等指标的标识外,也规定了酸溶蛋白的标识要求。

在上述7 种单一饲料原料中,目前仅发布了一个产品的标准《饲料原料 发酵豆粕》( NY/T 2218-2012),其中对酸溶蛋白进行了规定,控制指标为:占粗蛋白质含量≥8.0%,标准中同时确定了发酵豆粕中酸溶蛋白的检测按 《大豆肽粉》( QB/T 2653-2004)中规定的方法执行。

2原理及标准

酸溶蛋白即分子量较低的蛋白水解物,包括肽和游离氨基酸,主要是可以溶于酸性(三氯乙酸)溶液的蛋白,故又名三氯乙酸可溶蛋白。分子量较大的蛋白遇酸会沉淀,分子量小的蛋白可溶于三氯乙酸,据此特性可以确定其测定原理:利用大分子蛋白质在三氯乙酸(TCA)溶液中沉淀,除去酸不溶蛋白质,然后测定酸溶蛋白,即将酸溶蛋白与硫酸和催化剂一起加热消解,使蛋白质分解,其他步骤和内容与粗蛋白测定的步骤和内容相同。对应于上述定义和原理,在不同产品标准中对酸溶蛋白的测定步骤的规定如下:


2.1 轻工业标准《大豆肽粉》(QB/T 2653-2004)

称取样品2.00 g,加入15%TCA(三氯乙酸)溶液10 mL,混合均匀,静置5 min。将溶液定量转移,在4 000 r/min 离心下10 min 后,取全部上清液,按食品中蛋白质的测定规定的方法测定上清液可溶蛋白质。


2.2 国家标准《大豆肽粉》(GB/T 22492-2008)

准确称取样品1.0 g (精确至0.001 g),加入15%三氯乙酸(TCA)溶液溶解并定容至50 mL,混匀并静置5 min,过滤,去除初滤液,滤液作为备用液。吸取10.00~25.00 mL 滤液,以下步骤按照粗蛋白测定的步骤进行即可。


2.3 农业行业标准《饲料原料发酵豆粕》(NY/T2218-2012)

按QB/T 2653 规定的方法执行。

3材料与方法

3.1 仪器与试剂

仪器:BS 210S 电子天平;ZM 100 旋风磨;FOSS 2300 半自动凯氏定氮仪及其消煮炉装置。试剂:三氯乙酸、无水乙醚、盐酸、硼酸、硫酸、氢氧化钠(均为分析纯),凯氏定氮高效催化剂片。


3.2 测定方法

参考上述3 个产品标准,对QB/T 2653-2004 和GB/T 22492-2008 标准中规定的检测方法进行比较分析发现,2 个方法在样品前处理阶段除称样量、溶液体积和消解液体积不同外,分离方式也存在差别,为考察标准中涉及的前处理方式对结果的影响,结合实际情况,设计了3 种前处理方式,具体内容如下:

方法1:称取2.0 g 试样,溶于10 mL 15%三氯乙酸溶液,4 000 r/min 离心10 min,取全部上清液消化,其余同粗蛋白质的测定(QB/T 2653-2004)。

方法2:称取1.0 g 试样,溶于50 mL 15%三氯乙酸溶液,磁力搅拌30 min,过滤,取10 mL 滤液消化,其余同粗蛋白质的测定(参考GB/T 22492 -2008)。

方法3:称取0.5 g 试样,加入25 mL 15%三氯乙酸溶液,4 000 r/min 离心10 min,取10 mL 滤液消化,其余同粗蛋白质的测定(参考GB/T 22492-2008同比例提取,参考QB/T 2653-2004 中分离方式)。同时,对部分样品进行了粗蛋白含量的测定,测定方法采用《饲料中粗蛋白测定方法》(GB/T 6432-1994)。

4结果与讨论

4.1 检测结果

采用3 种方法测定不同单一饲料中的酸溶蛋白含量和样品中的粗蛋白含量,检测结果见表2。


由表2 可知:

(1)与普通豆粕相比,发酵豆粕中的酸溶蛋白含量有较大提高,达到10%以上,符合NY/T 2218-2012标准中的要求,与相关文献报道的结论相符。

(2)分别按照QB/T 2653-2004 规定的方法(方法1)和按GB/T 22492-2008 的规定改变提取体系及消解液体积后的方法(方法3)对样品进行测定,结果无显著差异,说明2 个标准中规定的提取体系(称样量和溶液体积) 以及消解液体积的差异不会对结果产生影响。

(3)分别按GB/T 22492-2008 和QB/T 2653-2004规定的方法对不同样品中的酸溶蛋白进行测定,结果存在显著差异,对结果进行分析,如图1 所示。由图1 可以看出, 采用过滤法(参考GB/T22492-2008) 测得的酸溶蛋白含量显著高于采用离心法(参考QB/T 2653-2004)测得的酸溶蛋白含量(P<0.01),二者存在较好的线性关系(R2=0.999)。针对结果检测过程分析原因,采用离心后取上清液进行全部转移测定酸溶蛋白的方法中容易出现离心后上清液不能完全转移的情况,会导致部分损失,但实际计算时按10 mL 全部转移进行计算,使得结果偏低。王芳等对样品进行不同的前处理研究结果也表明分离沉降过程是否完全、溶液是否定量转移对结果的准确性有影响。GB/T 22492-2008 标准中将酸溶蛋白测定的样品前处理分离沉降过程由QB/T2653-2004 标准中的离心法改为过滤法,应该是充分考虑了此因素的结果。

5结论

(1) 在试验过程中,当采用离心法测定粕类样品(如豆粕、棉籽粕等)时,大量杂质易漂浮于液面,从而使分离不完全,最终导致测定结果的不准确与不稳定。因此,根据本研究的结果,参考GB/T22492-2008 中规定的方法(即过滤法)对要求强制标识的酸溶蛋白指标的单一饲料原料产品进行酸溶蛋白的检测,测定结果稳定可靠。

(2) 尽快组织制定针对上述7类饲料原料产品中酸溶蛋白的检测方法标准,以便规范《目录》中的强制标识。

(3) 进一步扩大检测范围,应用确定的检测方法进行酸溶蛋白的测定,以实际样品的检测结果为《目录》在饲料行业的施行提供技术支持。

注:本文由工程中心小编整理发布,如有任何建议或意见及投稿等,请您加小编微信(FEEDMWJ)交流互动。

责编:马维军;审阅:陈达

(来源:中国畜牧杂志;作者:肖志明,李丽蓓等)

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