【组学专栏】如何应用蛋白质组学技术进行肿瘤研究思路设计

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作者：解螺旋.APT

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【组学专栏】第二讲

蛋白质组学技术在肿瘤学研究中的应用

　　基于质谱的蛋白质组学（proteomics）是近年来研究蛋白质的表达模式与功能模式的一门新兴学科，它能够在大规模的水平上进行蛋白质的表达变化、翻译后修饰以及蛋白质与蛋白质的相互作用等研究。相比于其他的蛋白质研究技术与方法，基于质谱技术的蛋白质组学具有的特点及优势包括：

　　① 对于通常研究的模式动物，基于质谱技术的蛋白质组学的一次实验往往能够输出上千级别的数据量，并且能同时提供定性、定量和翻译后修饰等信息，从而能够从更加全面、整体和网络的角度阐明蛋白质的功能与作用机制；

　　② 质谱技术的分析方法是基于蛋白质的化学组成对蛋白进行解析，因此能够更好的区分蛋白质的亚型及修饰变化；

　　③由于此类技术不受抗体的限制，在蛋白质新功能的发现与研究方面具有独特优势，进而更好地服务于高水平的创新研究。通过结合其他的分子、细胞以及药理学技术，蛋白质组能够为阐释复杂生物过程提供有效基础与思路，被称为强大的“hypothesis-generating engine”。

　　概括地说，在肿瘤学研究中，基于质谱技术的蛋白质组学主要应用于以下三个方向的研究和探索：

　　① 比较不同正常样品与肿瘤样品或不同处理条件下样品中大量蛋白质的表达量差异变化；

　　② 大规模分析蛋白质的翻译后修饰位点以及不同条件下的蛋白质修饰水平变化；

　　③ 解析蛋白质复合物组成或者蛋白质相互作用关系与网络。鉴于基于质谱技术的蛋白质组学强大的蛋白质定性、定量能力，随着相关技术的发展与成熟，蛋白质组学的研究方法与模式已成为肿瘤学科研中的主流蛋白质研究方案。

　　目前，基于质谱技术的蛋白质组学研究的主要思路和模式有两种——差异比较蛋白质组学和鉴定蛋白质组学。

　　I 差异比较蛋白质组：通过蛋白质组学的技术与方法，同时解析出不同组样品间大量的差异表达蛋白质，在此基础上进一步选取候选蛋白质，进行后续的表达验证及功能研究，进而阐明在特定生理或病理过程中相关蛋白质的作用。

　　II 鉴定蛋白质组学：通常以目标蛋白质为研究的出发点，寻找与其相关的其他蛋白质，进而阐明蛋白功能复合物、信号转导通路的组成与功能，以及蛋白质与蛋白质之间的相互作用。

　　基于质谱技术的蛋白质组学研究是近年来肿瘤生物学研究的最前沿领域和热点。肿瘤的发生、发展是多因素、多通路共同参与的复杂过程，蛋白质组学技术可以更为全面地阐明肿瘤发生发展过程中相关蛋白功能、变化以及信号通路的组成。目前，蛋白质组学研究思路和相关技术已被广泛应用在肿瘤的发生、转移、肿瘤干细胞、肿瘤微环境、肿瘤免疫等诸多研究领域，为揭开肿瘤病理机制、发现抗肿瘤治疗靶点，提供了强大的工具。

SCI中蛋白质组学技术研究肿瘤

应用举例

在肿瘤相关蛋白定量研究中的应用

　　利用非标记（2D，Label free）及标记（DIGE、SILAC、iTRAQ）定量的蛋白组技术与方法，可以实现对不同样品中的大量蛋白进行大规模的相对定量研究，进而为相关具体机制的深入阐明提供基础和思路。

　　癌症发生机制研究方面，Kikuchi等人利用非标记的Label free方法分析了临床非小细胞肺癌组织与正常肺组织的蛋白质组差异，共鉴定到了3621 个蛋白质, 并发现其中758个蛋白质在两组样本中存在显著地表达差异。利用生物信息对差异数据进行进一步的分析和筛选，作者选取了其中一些差异表达蛋白进行了进一步地表达验证和功能研究，并证实p21-activated kinase 2的差异表达在非小细胞肺癌的增殖与转移过程中具有重要作用，可能成为非小细胞肺癌治疗的新靶点。相关成果发表在2012年《Molecular & Cellular Proteomics》上。基于该蛋白质组学实验发掘的大量蛋白质差异表达数据，该研究团队在后续的研究中选取了其中另外一个差异表达蛋白——SLC1A5 (solute-linked carrier family A1 member 5)进行了进一步地功能研究，并于2013年在《Clinic cancer research》上发表了关于SLC1A5通过介导谷氨酸转运影响非小细胞肺癌生长和存活的论文。

　　肿瘤转移研究方面，为了阐明epidermal growth factor receptor (EGFRvIII)突变导致多形性胶质母细胞瘤表现出高浸润表型的分子机制，Mukherjee等人发表于2009年《Cancer Research》的研究，利用iTRAQ的方法分别标记了野生型（wtEGFR）和突变型(EGFRvIII)肿瘤组织样本，并检测了两类样本中蛋白质组的表达变化，发现了18个蛋白质在两类样本中存在>1.5倍的表达差异。在此基础上，作者从差异表达蛋白质中选取了细胞侵袭相关蛋白CRMP1进行了进一步的表达和功能验证，并最终证实CRMP1缺失对EGFRvIII突变多形性胶质母细胞瘤的高浸润表型具有重要贡献。Schliekelman等2011年发表在《Cancer research》的研究利用SILAC的方法对miR-200缺失诱导上皮细胞间质转化（EMT）的高转移肺腺癌细胞与非高转移腺癌细胞进了标记，并检测两组细胞的全细胞裂解液、细胞表面蛋白质及条件培养基中的蛋白质表达差异：发现了大量新的与肺腺癌转移相关的蛋白质，尤其是肿瘤转移中发生的大范围的微环境的改变，并构建了TGF-β作用分子信号网络。通过比较microRNA-200缺失后肿瘤细胞蛋白质组的差异表达，作者证实了microRNA-200限制EMT发生和转移的作用是通过直接调节细胞外基质蛋白和肽酶实现的。

　　肿瘤干细胞研究方面，为了发现新的肿瘤干细胞生物标志物，Ching-Huai Ko等利用iTRAQ的方法，通过比较肝癌细胞与肝癌干细胞的蛋白质组差异，发现了一些新的可用于鉴定肝癌干细胞的生物标志物，并对相关差异表达蛋白质的功能进行了验证。在肿瘤干细胞功能研究方面，利用DIGE-MS的方法，Thirant等发表于2012年《Stem cell》的研究比较了神经胶质瘤干细胞样细胞与神经干细胞的蛋白质组表达差异，发现肝癌衍生生长因子（HDGF）在神经胶质瘤干细胞中显著地高表达，进而进一步证实HDGF是一个新的神经胶质瘤干细胞相关的血管新生因子。

　　肿瘤微环境研究方面，Zeng等利用SLIAC的方法研究了肿瘤细胞与正常上皮细胞共培养条件下细胞分泌蛋白组的变化，鉴定到了共培养体系细胞上清中45个表达增加超过2倍的蛋白质，这些蛋白均与肿瘤相关的生物过程有关。此研究为后期研究肿瘤细胞与微环境细胞间的相互作用提供了基础。

　　除了相对定量，利用基于选择性/多反应监视（SRM/MRM）质谱技术的蛋白组学，可以实现对复杂样品中的目的蛋白进行绝对定量。2011年发表在《PNAS》的研究利用SRM的蛋白质组学方法检测了不同肿瘤细胞系中Ras突变蛋白的表达。SRM实验发现平均每个SW480结直肠癌细胞中有大约1.3*106个野生型Ras蛋白，突变Ras与野生型Ras的比例为5.6。同样的方法也被用于进行正常结直肠组织、结直肠癌肿瘤组织和胰腺囊肿液等临床样本中Ras突变蛋白的绝对定量。

在肿瘤相关蛋白定性研究中的应用

　　利用shotgun的蛋白组技术，可以实现对复杂样品中大量蛋白质的定性分析，进而为阐明肿瘤相关蛋白质的相互作用、信号通路组成及蛋白质亚细胞定位提供依据。

　　Dawson等人发表于2011年《Nature》上的研究，利用蛋白组学的方法鉴定了肿瘤发生过程中参与染色质修饰失调的bromodomain and extra terminal（BET）家族复合物的组成。作者首先分离出细胞核成分，再分别以BET抑制剂、Histone tails及BET抗体为基质，通过免疫沉淀或pull down的方法分离出BET各蛋白亚型及其他蛋白复合物。利用shotgun的方法对分离的蛋白质进行鉴定，作者发现混合系白血病融合蛋白的分子伴侣SEC 和PAFc是BET复合物的主要成员，并利用鉴定到的蛋白质构建了BET复合物蛋白相互作用网络。在此基础上，作者进一步证实BET复合物的功能与混合系白血病有直接关系，BET是混合系白血病的有效治疗靶点。

肿瘤相关蛋白翻译后修饰研究中的应用

　　肿瘤发生与发展过程中，除了表达差异，很多蛋白质的功能受到翻译后修饰的调控。利用蛋白质组学的方法，可对肿瘤相关蛋白质的修饰进行的定量及定性分析，为激酶信号通路、组蛋白修饰等研究提供基础。

　　Kim等在2013年发表于《PNAS》上的研究，利用磷酸化蛋白组学的方法研究了TANK-binding kinase 1 (TBK1)促进肺癌细胞存活过程中的磷酸化信号转导通路。作者共鉴定到了A549细胞裂解液中的2080个磷酸化蛋白质中的4,621 个磷酸化肽段, 其中385个蛋白质(477个肽段)的磷酸化水平在TNK1敲除后发生了至少1.5倍变化，由此作者构建了TBK1的磷酸信号转导网络。作者进一步发现Polo-like kinase 1 (PLK1)在该网络中处于核心位置，进一步的实验证实TBK1可在体外直接诱导PLK1发生磷酸化。另一方面，蛋白组学数据表明TBK1敲除后， metadherin在Ser-568位点上的磷酸化显著减少，进一步的功能研究证实metadherin与TBK1敏感的肺癌细胞的存活和增殖及肿瘤预后密切相关。

展望

　　综上所述，基于质谱技术的蛋白质组学方法具有的强大蛋白质定性、定量和蛋白翻译后修饰分析能力，其研究模式与方法已成为蛋白质层面上研究肿瘤学研究的主流方案，并已取得了大量的研究成果。

• 利用差异比较蛋白质组学的方法对不同组别样品中大量差异表达蛋白进行解析，进而从中选取候选蛋白进行进一步的表达验证和功能研究，可为深入阐明相关蛋白在特定生理或病理过程中的作用提供研究基础与思路；

• 借助于大量发掘的蛋白质差异表达数据，还可对信号通路的组成进行系统地描绘与功能研究；

• 利用鉴定蛋白质组学对pull down或免疫沉淀等方法分离纯化的蛋白复合物进行解析，则可为蛋白与蛋白的相互作用、抗原-抗体识别、酶-底物反应等研究提供强大的工具。

　　鉴于其独特的技术优势与研究特点，基于质谱技术的蛋白质组学在基础医学科研领域必将具有更为广阔的应用前景。

【组学专栏预告】

• 蛋白质组学应用案例1：探究药物作用机制 ；

• 研究糖尿病作用机制

• 蛋白质组学期刊介绍

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