听课笔记之蛋白质谱的原理及使用(三)

2023-05-18 23:00:13

写在前面

从10月底开始,由克里克学院与康昱盛主办的蛋白质组学网络大课堂正式开班了!整个课程由21堂大课组成。作为蛋白质组学纯小白一枚,小编也打算借这个机会好好学习感受一下。继第一讲“蛋白质组学研究方法概述”和第二讲“蛋白质谱实验样品前处理”之后,小编再接再厉,整理了第三讲“蛋白质谱的原理及使用”的听课笔记,分享给各位。


前面跟大家分享了质谱仪的原理、性能参数,以及串联质谱仪的工作方式,错过的小伙伴请戳:


>>听课笔记之蛋白质谱的原理及使用(一)

>>听课笔记之蛋白质谱的原理及使用(二)


今天我们要分享的内容是液相色谱仪的构成,以及液质联用是如何实现的。


授课老师

这次课程的授课老师是来自中国农业大学生物学院的李溱老师。李老师于1999年本科毕业于北京师范大学,2007年于美国德克萨斯州Texas A&M大学获得博士学位,2008年-2009年在University of Illinois at Urbana-Champaign从事博士后研究。于2011年加入中国农业大学生物学院,任副教授,在植物生理学与生物化学国家重点实验室及中国农业大学“985”功能基因组中心生物质谱实验室工作,负责生物质谱实验室日常运行,对外提供蛋白质组学和代谢组学技术服务,并开展基于高分辨质谱技术的植物代谢组学和蛋白质组学研究工作。李老师对各种质谱仪器的原理、特点及运行维护有着非常丰富的理论积累和实践经验,很有幸能邀请到他为我们介绍蛋白质谱的原理和操作。


(文中所有图片均来自李溱老师的讲义,并获得发表授权。)


本次课程的内容分三大部分:

  • 质谱仪的原理、使用与维护

  • 纳升型液相色谱仪的使用与维护

  • 生物质谱运行状态的评估


液相色谱仪

1906年,一位叫Tsweet的俄国科学家,发现了这么一个现象:在一个玻璃管里放了一些碳酸钙的粉末,也就是石灰粉,然后把胡萝卜捣碎后的石油醚提取液加到柱子里,随着石油醚的流动,他发现在柱子上形成不同的色带,其实就是胡萝卜里包含的各种色素在碳酸钙柱子里被分离开了。由于观察到不同的色带,所以他管这种现象叫色谱。

我们通过下面的示意图来理解一下这个现象的原理。胡萝卜提取液中含有不同的色素,柱子上的碳酸钙会对这些色素产生形成吸附作用,而不同的色素,因为理化性质不同,则与碳酸钙固定相的吸附作用力也不同。吸附力强的色素,在里面停留的时间就会长一些,比如说图中的黄色物质,它是最后被洗下来的,而吸附力弱的色素,比如绿色的物质,就很容易被石油醚冲下来,所以它第一个被洗脱。

所以色谱分离的原理就是利用待分离物质与固定相(比如上例中的碳酸钙柱子)和流动相(比如用来冲洗色素的石油醚)之间相互作用的差异来实现分离。


根据相互作用类型的不同,色谱法又可以分为:

--吸附色谱法:物理吸附法


--分配色谱法:根据溶解度的不同,却多肽疏水性的差异


--离子交换色谱法:根据多肽等电点的差异,依靠阴阳离子相互作用


--尺寸排阻色谱法:根据分子尺寸和分子量的不同


--亲和色谱法:利用抗原抗体和其它特异性作用

目前,在蛋白质组学研究中,用得最多的就是分配色谱法,就是根据样品在固定相与流动相之间溶解度的差异来实现多肽或蛋白的分离。实际上是利用了多肽或蛋白疏水性上的差异。


说到这里,问题就来了:在上一个例子中,固定相是碳酸钙粉末,是固体,那么蛋白或者多肽怎么可能会溶解到固体中去呢?


这里我们需要解释一下液相色谱的固定相。我们用的反相液相色谱的固定相叫做键合多孔硅胶。如果在电镜下将这种材料颗粒放大,就能看到它的表面是一种多孔的结构,长得有点像核桃的表面。


它的表面并不是纯粹的二氧化硅,而是通过化学修饰的方法,键合上去一些C18(十八烷基硅烷)。比如下面这个反应的示意图:

硅胶的表面是二氧化硅,水化之后形成硅羟基,然后通过化学反应,把图中含有Si, Cl, C的化合物结合到二氧化硅上去,形成长链烷烃的结构。长链烷烃其实就是一种油,通过这种化学反应,相当于在二氧化硅的表面涂上了一层油膜,只不过这不是简单的涂抹,是“化学涂抹”,连接上去的油层是很稳定牢靠的。于是,多肽就可以溶解在这层稳定的油膜里。所以,对于疏水性更强的多肽,更容易溶解在油膜里,亲水性强的多肽,则不容易溶解在油膜里,于是就实现了不同极性多肽的分离。


这种颗粒有多大呢?我们常用的液相色谱填料的颗粒直径是在1.7μm - 5μm之间,是非常小的,与之前Tsweet例子里用的碳酸钙粉末完全不在一个数量级上,碳酸钙粉末颗粒的直径是在100μm-200μm之间。


明白了液相色谱的原理以后,我们来学习一下它的构成,主要有四个部分:

色谱仪组成

1、 色谱柱:玻璃柱+固定相


2、 流动相输送系统:对于Tsweet那个实验,没有专门的输送系统,是靠重力使得样品流过固定相。对于现在的实验来讲,我们用的色谱柱填料是非常细的,只有一点几微米到几微米,这时候靠重力是很难让流动相流下来的,而是需要用一个泵来把流动相挤压下去。所以液相色谱要配一个泵系统,来输送流动相。


3、 进样系统:对于Tsweet实验,只需要用手把样品倒进柱子里,就算进样了。而现在我们都是用密封的系统,需要一个自动进样器来完成。


4、 检测系统:现在常用的有紫外或荧光,最简单的就是用肉眼来观察是否有样品流出。


一个液相色谱仪,通常就是由这四个模块组成。我们来看下面两个实物图。左边是戴安的液相色谱仪,从上往下依次是泵系统、进样系统、柱系统和检测系统,右边是Waters的液相色谱仪,也是类似的结构。


对于我们蛋白质组学领域,常用的液相色谱仪是纳升液相色谱。它与普通的液相色谱最大的区别就在管子的粗细和流速上。下图是纳升液相色谱的管路和接头与常规液相色谱的比较。


首先,从外观上我们也能看出很大的不同。常规液相色谱的柱子内径是在1-5mm,而纳升液相色谱柱子就细了很多,与连接的管路粗细几乎是一样的,看上去就像一根线。加上外面的保护皮,这根线的外径也只有360μm,如果把保护皮扒掉,外径大概只有110μm-120μm,内径只有50μm。与常规的液相色谱柱相比,相当于把柱子的直径缩小了20-100倍。


当我们把柱子的内径缩小了20-100倍以后,流动相的流速也相应地变缓了很多。常规液相色谱的流动相流速通常是在0.2-1ml/min,而纳升液相色谱却只有50-300nL/min,这与常规液相色谱的流速比,下降了1000倍。


那么,为什么我们需要将流速下降1000倍呢?要回答这个问题,我们先来看看下面这张纳升色谱与常规色谱灵敏度的对比图。

我们分析2 pmol的肌红蛋白酶解产物,在不同直径的柱子中的灵敏度。比如,在4.6mm的柱子里,流速为1ml/min,我们几乎是看到紫外信号的;当我们把色谱柱逐渐缩细到1mm、300μm,直到180μm的时候,我们就可以看到非常清晰的紫外吸收峰,也就是酶解产物的谱图。


为什么会出现这种现象呢?


我们来回顾一下,当常规液相色谱的流速是1ml/min时,也就是说,我的样品会被1mL/min的液相所稀释,而当我们用纳升液相色谱时,我们会把流速降到300nL/min,相比于1mL/min,流速下降了3000倍,也就是说,样品被变相地浓缩了3000倍。由于样品的浓度被变相提高了很多,所以检测的灵敏度也就相应提高了。


这就是为什么我们要使用纳升液相色谱,就是为了减少样品被流动相稀释的倍数,从而提高检测的灵敏度。


那么,纳升液相色谱仪从外部看,有什么特点呢?其实它与常规液相色谱仪使用的泵都是一样的,但是管路这部分是不同的。下面是一个实物图,右侧的局部图展示的是流量控制器,进样的管路还是跟常规管路一样,是100mm的内径,而流出的管路外径就变成了180μm,内径只有50μm,用了非常细的色谱柱,可以缩减流动过程中体积的延迟,或者梯度的延迟。

Tips

梯度延迟是指梯度洗脱时色谱泵改变梯度后,色谱柱感受到这个变化所需要的延迟时间。常规液相色谱的梯度延迟约100-400微升,0.2-0.5 min,纳升液相色谱约1-5微升,5-15分钟。


介绍完液相色谱仪,我们再进一步说说,它是怎么与质谱仪联用的。


液质联用技术

实际上,对于蛋白质组学研究来说,液相色谱和质谱是不能单独工作的,它们必须联机工作,才能实现对蛋白质的检测。那它们是怎么实现联机的呢?可能你会说,弄个接口连起来呗!小编也觉得这是最直接的解决方案,但问题是,需要什么样的接口?


要回答这个问题,我们先来看看将液相色谱和质谱连接起来,需要面对哪些挑战?液相色谱仪是在常温常压下工作的,柱子是放在空气中运行的,而且样品是溶解在流动相(水或有机溶剂)当中的。而质谱仪需要在真空环境下工作,样品需要从溶液状态转化为气态,而且需要被电离。所以总的来说,我们需要一个电离源,能把样品从常温常压的液相状态直接变成真空中的气态离子状态。


我们再来梳理一下这个电离源需要具备的功能:

电离源功能

功能一:去溶剂和气化,把样品中的溶剂去掉,将待检测的多肽分子变成多肽的气态分子;


功能二:将多肽的气态分子离子化,让它们带上电荷;


功能三:把多肽的气态离子送到真空当中。


仅用一个电离源,就能同时实现这么多的功能?听上去貌似是件很难完成的任务!然后,就有这样一种技术被机智的人类发现了出来,很好地实现了上述功能,它就是ESI,即电喷雾电离!顺便说一句,这个技术的发明者,John Fenn,在2003年获得了诺贝尔化学奖。


ESI的主要原理是这样的:样品首先通过一个毛细管喷针,被喷出来,进入质谱仪。而在喷针的外面,会用一个鞘气(sheath gas)来辅助样品的雾化。这其实跟我们用的喷雾器或者喷壶是非常相似的道理。如果压喷壶,喷壶里的气或者水就会喷出来。


但是喷出来这一步,只能解决样品的雾化问题,样品实际上还是溶解在流动相中的。所以我们会对鞘气进行加热,当加热的鞘气吹到样品中或者溶液中时,溶液中的流动相或者溶剂就会挥发,就会剩下气态的离子。


同时,在毛细管喷针尖端与质谱仪的入口之间,还会加一个电压,叫High voltage,对这些待电离的分子,首先溶剂挥发掉,然后分子被气化,最后在电场的作用下,分子就会变成离子,实现电离的过程。然后,这些离子会被质谱仪入口处的真空抽到质谱仪里,同时被电场驱动进入质谱仪。于是,就实现了气化、电离以及真空过渡三重需求。这就是液相色谱与质谱的接口,即ESI电喷雾电离。示意图如下:



对于蛋白质组学研究来说,由于我们前面分离样品的时候使用的是纳升液相色谱,所以ESI电离源也需要做适当的改进,来适应纳升液相的特点,这种ESI我们叫做nanoESI,即纳升电离源。


对于普通的电离源,当使用鞘气的时候,电离源可以承受的流速通常是在0.1mL/min – 1mL/min,而纳升电离源的流速只有100-500nL/min,这种超低流速下我们已经不需要用鞘气来辅助喷雾,只需要依靠样品自身的挥发,以及样品的喷针针尖与质谱仪入口的电压差,就可以实现稳定的喷雾。也就是说,在这种情况下,我们只需要把喷针针尖的开口做得非常细(通常开口内径是在3-10μm),并且只需要1.5 -2.5kV的电压,就可以实现连续稳定的喷雾。


样品通过这个喷针出来以后,就会发生雾化气化,溶剂蒸发掉,然后样品发生电离,进入质谱。下面就是nanoESI的实物细节图,右下角就是喷针的特写照。




好啦,液相色谱的原理,以及与质谱的联用方式小编就介绍到这里,还是那句话,大家如果有什么问题,尽管留言提出来。下一篇我们会聊到质谱仪和纳升液相色谱的使用与维护,敬请期待吧~


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