听课笔记之蛋白质谱的原理及使用(二)

从10月底开始，由克里克学院与康昱盛主办的蛋白质组学网络大课堂正式开班了！整个课程由21堂大课组成。作为蛋白质组学纯小白一枚，小编也打算借这个机会好好学习感受一下。继第一讲“蛋白质组学研究方法概述”和第二讲“蛋白质谱实验样品前处理”之后，小编再接再厉，整理了第三讲“蛋白质谱的原理及使用”的听课笔记，分享给各位。

上一篇小编跟大伙儿聊了几种主要的质谱仪的原理及特点，错过的小伙伴请戳：

>>听课笔记之蛋白质谱的原理及使用（一）

接着上次的听课内容，今天我们来了解一下如何对一台质谱仪的性能进行评估，另外，小编还会分享一下串联质谱是如何工作的。

这次课程的授课老师是来自中国农业大学生物学院的李溱老师。李老师于1999年本科毕业于北京师范大学，2007年于美国德克萨斯州Texas A&M大学获得博士学位，2008年-2009年在University of Illinois at Urbana-Champaign从事博士后研究。于2011年加入中国农业大学生物学院，任副教授，在植物生理学与生物化学国家重点实验室及中国农业大学“985”功能基因组中心生物质谱实验室工作，负责生物质谱实验室日常运行，对外提供蛋白质组学和代谢组学技术服务，并开展基于高分辨质谱技术的植物代谢组学和蛋白质组学研究工作。李老师对各种质谱仪器的原理、特点及运行维护有着非常丰富的理论积累和实践经验，很有幸能邀请到他为我们介绍蛋白质谱的原理和操作。

（文中所有图片均来自李溱老师的讲义，并获得发表授权。）

我们作为质谱仪的使用者，怎么来评估一台质谱仪的性能呢？或者说，我们如何选择质谱仪呢？质谱仪主要的性能参数如下图，就让小编来依次为大伙儿解释一下这些高大上的参数名称到底是啥意思吧。

“官方”的定义是，与三倍噪音相当的物质的量，我们可以理解为这是质谱仪能够检测到的最低含量化合物的浓度，或者量。比这个值再低的化合物，这台质谱仪就无能为力了。

我怎么知道我的质谱仪的检测限是多少呢？通常，我们会用利血平来作为一个标准的化合物测定质谱仪的检测限。比如，当我们在质谱仪中注入50 fg（飞克）利血平，如果我们获得的信噪比能达到100-1000，那么可以认为这台质谱仪的检测限是不错的。50 fg（飞克）利血平中大概只包含了几万个利血平分子，也就是说，如果能实现对含有几万个小分子的化合物进行检测，那么这台质谱仪的灵敏度是挺高的了。大家可以认为，灵敏度与检测限评估的是同一种性能。

这个性能参数也是挺重要的。它表示在什么样的浓度范围之内，质谱仪检测到的信号与样品浓度之间成线性的关系。说得简单点，就是这个浓度范围内的样品，用这台质谱仪检测是比较合适的，高于或低于这个浓度范围的样品，需要浓缩或者稀释后才能用这台质谱仪检测。

通常情况下，质谱仪的线性范围是在3-6个数量级，也就是1,000 – 1,000,000这个范围之内。大部分质谱仪是在1,000 – 10,000这个范围内。

这个参数之所以重要，是因为当我们分析的样品含量分布非常广的时候，比如有的样品含量只有几十μg/ml，而有的样品含量可以达到几mg/ml。在这个比较宽的浓度范围内，如果质谱仪的线性范围非常好，我们不需要浓缩低浓度的样品，也不需要稀释高浓度的样品，可以直接进样，这样可以大大减少样品前处理的复杂程度，很好地节省时间，节省实验步骤。

这是两个非常重要的参数，我们常说的高分辨质谱，指的就是分辨率特别高，且质量准确度特别高。这两个参数怎么理解呢？我们先来看看下面这个图：

目前我们能用到的高分辨质谱仪，不管是QTOF或者Orbitrap系列，都可以达到50,000以上的分辨率，同时也可以达到2-3ppm的质量准确性。所以说，如今做蛋白质组学研究的童鞋们，比起以前，真是幸福了很多！

前面给大伙儿分享了评估质谱仪的几个重要参数。那接下来我们就针对不同质谱的性能做一个粗略的总结。

1、 四级杆和离子阱：它们的质量扫描范围是有限的，通常情况下是在10-4,000。超过4,000，四级杆和离子阱就只能作为离子传输用，而不能用于离子检测了。它们的分辨率通常是2,000-4,000，好一点的离子阱可以达到10,000-20,000。扫描速度都不是很快，它们的优势是价格非常低，而且整个仪器可以做得非常小。

2、 TOF：它最大的优势是可以测量的质量范围理论上可以无限大和无限小。如果待检测的离子没有质量，那么它的飞行时间将是0，于是可以测到质荷比是0的离子。同理，如果离子的质量是无限大的，那么它的飞行时间也是无限长的，理论上也是可以检测的。TOF的分辨率是5,000-60,000，扫描速度非常快，它的缺点是，TOF需要一个非常长的离子跑道，所以仪器的体积会很大。

3、 FTICR：优势是分辨率非常高，可以达到1,000,000甚至更高，缺点是扫描速度比较慢，而且它需要一个超导磁铁，运行费用非常高，而且FTICR质谱仪本身的价格也很高，通常都在100万美元以上。

4、 Orbitrap：克服了FTICR必须要使用超导磁铁的缺点，它的分辨率可以达到100,000到1,000,000万，扫描速度不是很快，价格比FTICR要低一些。它受专利保护，目前只有Thermo公司可以生产。

对于蛋白质组学研究来讲，我们对质谱仪器性能的最低要求是：分辨率至少在40,000-50,000，质量准确性应该优于5ppm，质量扫描范围应该在100-3,000，扫描速度是每秒至少获得一张高分辨的一级谱图和十张高分辨的二级谱图。达到以上条件的话，就算是满足了我们做蛋白质组学最基本的要求。

上面讲到各种质谱仪的优缺点，那么我们这里引入串联质谱的概念：将相同或者不同的质谱仪串联起来，实现串联或者并联工作。这样做的目的有两个：产生二级碎片离子（为什么要产生二级碎片离子我们后来会讲），以及实现不同质谱仪性能的优势互补。

我们知道，不同的质谱仪性能是不同的。比如说，四级杆质谱可以实现离子选择，但它的分辨率比较差，而TOF不能实现离子的选择，但分辨率比较高。那么我们能不能把不同性能的质谱仪串到一起，让它们协同工作呢？我们通常会利用串联质谱或者MS-MS来实现这个需求。它们的结合方式有很多种：

第一种：三重四级杆（Triple Quadrupole），或者串联四级杆，就是把三个四级杆串联起来，这样做的主要目的是为了实现二级质谱的扫描。

第二种：四级杆和飞行时间质谱仪串联到一起，就是我们经常听到的Q-TOF，它实际上是为了提高二级质谱的分辨率。

第三种：Orbitrap与四级杆组合，比如Orbitrap Fusion，或者Orbitrap与离子阱组合到一起，比如说Orbitrap Elite等，就是这样的组合。

首先，我们聊一聊怎么通过串联质谱仪获得二级碎片离子。

上面是一个串联四级杆结构的示意图。串联四级杆，或者叫三重四级杆，它是由三个四级杆串联起来。通常，第二个四级杆是由六级杆或八级杆来代替，但我们还是叫它四级杆。这个四级杆不是一个质量选择系统，而是一个collision cell，即碰撞池，用来碎裂离子。

当串联四级杆工作的时候，第一个四级杆是开启了质量选择的模式，它让特定质荷比的离子穿过质谱仪，而把其它的离子都甩掉（甩到四级杆上，或者甩到四级杆的空间当中去）。然后，当特定的离子被选择好后（称为母离子），会进入碰撞池。

在碰撞池里有这样一个结构，就是入口和出口存在电压差，通常入口电压会高于出口电压，当母离子进来以后，通过电压差的作用，就会被加速。而且碰撞池里会充上氦气或氮气，当离子被加速以后，它就会与碰撞池里的氦气或氮气分子发生碰撞、碎裂，形成一些碎片，叫做fragment ions，也就是碎片离子，或者子离子。这些碎片离子会进到第三个四级杆中，进行二级的扫描，得到二级质谱图。

下图就是一个串联四级杆质谱仪，我们可以看到，它仍然是一个非常紧凑的结构。

上面小编分享了几种常用的质谱仪，那么以Q-TOF为例，我们再来学习一下质谱仪的基本构造。

对于质谱仪来说，最核心的部分就是质量分析器，它包括两个部分，就是前面我们详细介绍的质量过滤器和质量检测器。质谱仪所有其它部分都是为这个核心部分来服务的。

除了这个核心的组件以外，质谱仪还需要以下几个部分辅助：

加上核心组件质量分析器，以上就是组成质谱仪的六大系统。后面我们还会讨论每一部分的结构、使用以及维护。

安装好这六大组件的质谱仪可以用下面的示意图来表示。通常情况下，质量分析器和高真空的涡轮泵都会装在一个大盒子里，这个模块叫主机，而低真空泵（油泵）会放在主机的外面，因为这部分会产生很多的震动、噪音和热量，需要分开放置，从而防止震动对质谱仪产生的影响。质谱仪前面会有一个离子源，侧面会有一个废气口，质谱仪和泵产生的废气，通过这个排气管排到室外。尤其是泵产生的废气，通常是致癌的，所以排气尤其重要。

今天小编分享了课程中学习到的如何评估质谱仪的性能、串联质谱仪的工作原理，以及组成质谱仪的六大组件，大伙儿是否都清楚了呢？如果有什么问题，请给我们留言吧。下一篇小编将会聊聊液相色谱仪的构成，以及液质联用设备的工作原理，欢迎继续关注。

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