你们是否有数据能够证明克隆到藻类载体后的蛋白表达水平?-福建水产设备联盟

“蛋白表达”疑难解惑第十弹：藻类表达支持

你们是否有数据能够证明克隆到藻类载体后的蛋白表达水平？

下图A描述了木聚糖酶克隆到pChlamy_4载体并转化到Chlamydomonas reinhardtii 137C中。利用EnzChek®Ultra木聚糖酶检测试剂盒进行检测，发现酶活性比原来的系统高17.6倍。图B描述了B-葡萄糖醛酸酶（GUS）基因克隆pSyn_6并转化到Synechococcus elongatus中。结果，GUS活性水平比我们原来的系统高100倍以上。

如何检测藻类细胞的生长？

可通过OD750检测细胞生长，线性范围将在0.2-1.2（在1 cm光路中）之间。如果所得OD值过高，请稀释并再次检测。完全生长通常需要5-6天。可利用赛默飞的Countess细胞计数仪或Tali 细胞计数仪进行精确检测。计算细胞数量的公式如下：

细胞浓度（细胞/mL）=

(OD₇₅₀ – 0.088)/9× 10⁸ = (OD₇₅₀ – 0.088)/(9 × 10^-8)

请注意，我们的COA指出，“将240 μl的冻存细胞复苏，并使用6 mL Gibco TAP培养基在28°C和50 μE下培养。生长6天后，在750 nm下检测光密度。光密度必须达到0.6。每批次至少取6管进行存活率测试”。

使用衣藻基因工程试剂盒进行整合的原理是什么？

整合是随机的。基因工程试剂盒是基于随机插入，这会导致目的基因快速丢失。蛋白表达试剂盒含有pChlamy_4载体，经过设计可表达出带有博来霉素/Zeocin抗性基因sh-ble的转录融合蛋白（Rasala et al., 2012）。口蹄疫病毒（FMDV）2A肽段的自切割序列位于抗生素抗性基因和目的基因之间。该序列可编码一个约20个氨基酸的短序列，介导发生适当切割并产生2个独立蛋白。

我们使用该系统得到的阳性转化株，即使在有或无筛选压力下传代多次之后，依然能够维持高表达水平，其持续时间远远长于其他系统。

预期的转化效率是多少？

我们未报导衣藻细胞的转化效率，因为转化的最终结果是随机整合到基因组。电穿孔结果取决于目的基因。每个电穿孔反应中，对照载体应产生最少30个转录株。在每个挑选出的菌落中，目的基因阳性克隆数应不少于90%。

核转化与叶绿体转化有何区别？

下列文章对叶绿体转化与核转化的优势做了一些讨论，请查看：

Fischer et al. (2004) Plant-based production ofbiopharmaceuticals. Curr Opin Plant Biol 7:152–158.

Kindle et al. (1991_ Engineering the chloroplastgenome: Techniques and capabilities for chloroplast transformationin Chlamydomonas reinhardtii. Proc Natl Acad Sci U SA 88:1721–1725.

使用pChlamy_1或pChlamy_3载体时，由于出现基因沉默而得到较低的表达。你们有何建议？

很遗憾，基因沉默是藻类表达中的一个大问题。

沉默程度取决于基因序列和从该基因表达到细胞中的蛋白的毒性。pChlamy_4载体专为避免发生常出现于C. reinhardtii的转基因沉默而设计。同时，该载体经过设计，可表达出带有博来霉素/Zeocin抗性基因（sh-ble）的转录融合蛋白。口蹄疫病毒（FMDV）2A肽段的自切序列位于抗生素抗性基因和目的基因之间。该序列可编码一个约20个氨基酸的短序列，介导发生适当切割并产生2个独立蛋白。

我们使用该系统得到的阳性转化株，即使在有或无筛选压力下传代多次之后，依然能够维持高表达水平，其持续时间远远长于其他系统。

使用pSyn_1载体时，目的基因的基础表达很低。你们有何建议？

pSyn_1的启动子是Psc。Psc是一种弱组成型启动子，可启动目的基因的基础表达。而pSyn_6的启动子是psbA启动子（PpsbA）。PpsbA是细长聚球藻psbA基因（编码光合系统II蛋白D1）的一种强组成型启动子，可启动目的基因的高水平表达。

我正在使用藻类MAXEfficiency 转化试剂转化衣藻。但是，转化效率非常低。如何能够对此进行改善？

请查看以下建议：

1.为得到最佳结果，藻类细胞浓度应在1 x 106至2 x 106细胞/mL之间（OD范围为0.3-0.5）。细胞浓度不可超过3 x 106细胞/mL。可通过OD750检测细胞生长，线性范围将在0.2-1.2（在1 cm光路中）之间。如果OD值超出线性范围，请稀释并再次检测以获得准确读数。

公式为：细胞数= (OD₇₅₀ – 0.088)/ 9 × 10⁶ /mL

2.线性DNA转化比环状DNA转化的效率高很多（有效率约高出70%）。

3. DNA的质量和浓度对于转化效率至关重要。您将需要使用PureLink®HQ、PureLink® HiPure或相同质量的质粒纯化试剂盒进行DNA纯化。使用小体积的浓缩纯化DNA要比使用大体积的低浓度DNA更好。（如果您在转化线性质粒，则在线性化之后，您将需要在转化前使用凝胶提取或PCR净化试剂盒对质粒进行纯化处理。）我们建议每次电穿孔使用2 µg的线性质粒DNA。

4.质粒DNA是随机插入到基因组的。通常，只有20%的转化株会明显表达目的基因。我们建议首先通过菌落PCR对菌落进行筛选，确保启动子和目的基因的完全整合，随后通过筛选多个阳性克隆，挑选出表达水平最高的克隆。

5.由于C. reinhardtii基因组具有非常高的GC含量（约62% GC），如果目的基因适应了高表达C. reinhardtii基因的密码子使用偏好，则重组基因的表达水平会明显改善。

6.由于转化效率取决于构建体向基因组的随机整合，电穿孔结果将取决于目的基因的性质。您可尝试转化试剂盒中的对照载体，从而确认试剂盒及其电穿孔方法是有效的。

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