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文章来源：中华糖尿病杂志, 2018,10(4) : 251-255
作者：汪志红 何慈江
单位：重庆医科大学附属第一医院内分泌科 美国纽约西奈山伊坎医学院肾内科
糖尿病肾病（DKD）是糖尿病最主要的慢性微血管并发症之一，它是世界范围内终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）的最常见原因。由糖尿病所致的ESRD在美国及发达的亚洲国家，高达近45%；在中国虽然目前相对不高（15%~20%），但仍是ESRD的第二大病因[1,2]，而且随着近30多年来中国糖尿病患病率的迅猛增加，糖尿病所致的ESRD势必会随时间进展而显著增加。由于ESRD患者需要昂贵的透析或者肾移植治疗，并且心血管事件和死亡风险显著增加，这给患者及社会带来沉重的负担。因此，早期诊断和早期干预是防止DKD发生、发展，减少危害的核心策略。
微量白蛋白尿（microalbuminuria，MA）是肾小球受损的标志物，尿白蛋白/肌酐（urinary albumin-to-creatinine ratio，UACR）是目前广泛接受、相对可靠的用于早期诊断DKD和预测进展的指标。但随着研究证据的不断增多，UACR作为早期DKD的标志受到质疑，而且不足以预测DKD的进展。因为研究显示仅30%左右的MA患者进展；1/3的糖尿病伴MA患者可以逆转为正常蛋白尿；而正常蛋白尿的糖尿病患者可以出现肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）下降和肾脏结构的异常[3,4,5]；此外，其他肾脏疾病和全身性疾病也可以出现蛋白尿。由此可见，MA对DKD发生发展的预测特异性和灵敏性不高，迫切需要进行更好的研究，以找到特异性和灵敏性高、临床上实用的早期标志物来预测DKD的发生和发展。
目前已有不少研究在血、尿、肾脏组织中发现了一些有前景的预测DKD的标志物，包括肾小球/肾小管损伤、氧化应激、炎症、组学标志物。下面将根据标志物的性质和作用，将近10多年来发现的、最有前景的DKD早期标志物分为细胞因子及其受体、生长因子、足细胞标志物、急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）标志物、蛋白糖基化标志物、基质蛋白分子、组学标志物等，分别介绍其预测肾病进展的可能性和可靠性。
一、细胞因子及其受体
低度炎症参与了DKD的发病。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）是炎症的关键介质并在细胞凋亡中起着重要作用；在动物模型中，TNF-α可减少GFR，增加尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion rate，UAER）；其通过与血清中两个可溶性TNF受体（soluble TNF receptor，sTNFR）1和sTNFR2结合，诱导一系列的趋化因子和黏附分子的产生，从而导致炎症，引起肾脏损伤[6]。Joslin糖尿病中心的Niewczas等[7]测定了363例1型糖尿病（T1DM）伴正常蛋白尿患者、304例伴MA患者血中上述炎症标志物，通过多因素分析发现只有sTNFR1和sTNFR2与胱抑素基础上预估GFR（estimated GFR，eGFR）相关，而且sTNFRs较UAER对GFR具有更强的作用。随后，Gohda等[8]在无蛋白尿的肾功能正常的628例T1DM中，同样发现sTNFR1和sTNFR2与肾功能下降有关。Niewczas等[9]对2型糖尿病（T2DM）的研究，报道了类似的结果。在对无显性蛋白尿的日本T2DM患者的研究中，也发现基线的sTNFR1和sTNFR2与eGFR有关[10]。不过，一项DKD的队列研究显示，在入组时sTNFR1与肾功能高度相关，但随访1年后，sTNFR1与肾病的进展不相关[11]。总之，尽管目前的研究结论不完全一致，但多数研究均提示sTNFRs和肾功能变化密切相关，对DKD进展的预测很可能优于UAER。
二、生长因子
生长因子是指有促纤维化作用的因子，主要有转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）和结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）等。
TGF-β1是相对分子质量25 000的多肽，属于TGF-β细胞因子家族的成员。TGF-β主要由免疫细胞分泌，有促进伤口愈合，控制细胞生长、增殖、分化及凋亡的作用。肾小球系膜基质的扩张、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分的聚集是DKD病理改变的主要特征之一；而TGF-β1被认为是ECM形成的重要介质，是各种器官组织重塑及纤维化进程中最重要的驱动因子，包括肾小球[12]。Riojas等[13]测定了526例糖尿病患者尿中TGF-β1水平，结果显示血糖控制差的糖尿病患者尿TGF-β1水平较血糖控制好的糖尿病患者以及正常对照增加5倍，而且TGF-β1与糖化血红蛋白呈显著正相关。最近纳入9项随机对照临床试验，共有264例患者、227名健康对照的Meta分析显示，DKD患者血清TGF-β1水平增加，而且其水平与肾病的高风险相关，提示TGF-β1可能作为DKD的标志物并可预测其预后[12]。但鉴于目前各个研究的样本量少，尚需进一步研究进行验证。
CTGF是一个相对分子质量36 000~38 000的细胞蛋白，在TGF-β介导的生物活动中，CTGF参与了组织纤维化的过程。在DKD患者中，血浆和尿中CTGF的水平增高，尿CTGF增加与UAER增加以及GFR下降有关[14]。另一项318例T1DM和29名正常对照的横断面研究也发现，DKD患者中尿CTGF与UAER和GFR相关[15]。因此，尿CTGF被认为是预测DKD进展的标志物[14]。
三、足细胞标志物
突触足蛋白（synaptopodin）、肾病蛋白（nephrin）和足细胞标记蛋白（podocalyxin）是研究较多的足细胞标志物。
短暂肾小球损伤的大鼠模型足细胞尿与蛋白尿相平行，但随后足细胞尿消失，蛋白尿仍持续存在；而在持续肾小球损伤的5/6肾脏切除模型中，足细胞尿持续存在且与蛋白尿和高血压平行；但正常老龄化的大鼠则没有足细胞尿。此外，足细胞尿与肾内足细胞数量无关[16]，提示足细胞尿较蛋白尿而言，是更好的反映肾小球活动性损害的指标。Zheng等[17]提出可以通过测定尿中足细胞特异性的蛋白质或者mRNA作为糖尿病肾小球疾病的标志物。Wang等[18]对21例肾穿刺证实的DKD进行了肾脏组织学、足细胞计数、尿足细胞相关蛋白基因表达的研究，发现尿中synaptopodin mRNA水平与足细胞数量相关；但未发现尿中任何一个足细胞相关蛋白的表达与肾功能及肾间质的病变有关。
Nephrin是肾小球足细胞表达的跨膜蛋白，被认为是肾小球早期损伤的生物标志物。对T1DM的研究发现，有30%的患者出现MA之前，就观察到nephrin尿出现[19]。在UAER正常的T2DM中，也同样在50%的患者中检测到nephrin尿；且与白蛋白尿呈正相关，与eGFR呈负相关[20]。因此，nephrin尿可能成为早期DKD的标志物，并预测进展。
Podocalyxin是转膜黏蛋白CD34家族的成员，是肾小球足细胞多糖蛋白质复合物的主要成分。T2DM患者尿podocalyxin水平增加；甚至在出现MA之前，尿中podocalyxin就已升高，且与尿白蛋白水平相关[21]。在T2DM患者中，podocalyxin的mRNA水平与eGFR呈负相关，并随DKD的进展而增加[17]。由此可见，podocalyxin尿可作为早期测定和监测DKD的有用标志物。
四、AKI的标志物
对AKI的研究发现了一些敏感的标志物，主要有中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）及肾脏损伤标志物-1（kidney injury marker-1，KIM-1）。近来的研究提示这些标志物可能作为DKD的早期标志物，并可预测其发展。
NGAL是由2 178个氨基酸组成，相对分子质量25 000的脂质运载蛋白，它主要由肾小管对肾脏结构性损伤的反应而产生。Fu等[22]对蛋白尿不同分期的101例T2DM的横断面研究显示，患者尿NGAL显著增高，并随UACR的增加而升高；尿NGAL与eGFR负相关。对T1DM研究也证实在蛋白尿出现之前，尿NGAL已经升高；血/尿的UGAL与白蛋白尿和eGFR相关[23]。Kim等[24]测定了eGFR≥60 ml·min－1·（1.73 m2）－1的T2DM患者尿中肾小管损伤标志物，发现NGAL和KIM-1与白蛋白尿明显相关，尿NGAL和KIM-1可能是早期肾脏损伤可靠的标志物。总之，这些研究提示，肾小管损伤很可能紧随糖尿病而发生，因此监测其变化对DKD将来的转归有重要的生物学及临床意义。
五、蛋白质的终末糖基化
糖尿病控制与并发症试验（Diabetes Control and Complications Trial，DCCT）及英国前瞻性糖尿病研究（United Kingdom Prospective Diabetes Study，UKPDS）的随访分析提示，晚期糖基化终末产物（AGEs）的聚集可能是代谢记忆及氧化应激的重要携带者。在不同分期的DKD患者中，AGEs增高，且受血肌酐的影响。尿中AGEs有肾小管毒性作用，导致肾小管功能失调；在50%没有蛋白尿和85%伴有MA的T2DM患者中，尿中AGEs增加[25]。与AGEs及AGEs形成和聚集有关的标志物戊糖素，在伴MA患者中的水平高于无白蛋白尿的患者[26]。DCCT和UKPDS显示，强化降糖治疗后AGEs减低，DKD显著降低，提示AGEs及RAGE可能预测DKD的进展。
六、基质分子
由于ECM的沉积也是DKD的特征，测定尿中的基质分子可以提供肾病活动的指标。Ⅳ型胶原是系膜基质、近端肾小管细胞和足细胞的组成成分，是肾脏主要的基质分子。高血糖能刺激Ⅳ型胶原的合成，抑制其降解。在无白蛋白尿的糖尿病小鼠模型中，尿Ⅳ型胶原的升高与UAER和肾脏结构受损有关[27]。Tomino等[28]对亚洲糖尿病多中心的横断面研究显示，尿中Ⅳ型胶原的水平随DKD进展逐渐增加。Iijima等[29]对94例无明显蛋白尿的T2DM患者随访1年的研究发现，MA患者及正常蛋白尿进展至MA的患者，尿中Ⅳ型胶原的排泄增加明显，而维持正常蛋白尿的患者，其尿中Ⅳ型胶原水平明显降低，提示尿Ⅳ型胶原可能是评估早期DKD一个更好的指标。有学者还报道了231例伴正常蛋白尿或MA的T1DM平均7.4年的随访结果，发现尿Ⅳ型胶原，而不是UACR，与eGFR的变化密切相关[30]。这一结论在另一项日本T2DM患者8年的随访研究也得到了证实[31]。因此，可推测Ⅳ型胶原也是预测DKD进展的良好指标。
七、组学标志物
代谢组学、蛋白质组学、基因组学及非编码RNAs（non-coding RNA，ncRNA）及外泌体研究，是近年发展迅速的技术和手段，而且在DKD生物标志物研究中的应用日趋增多。
1．代谢组学：
代谢组学研究发现尿中马尿酸可作为肾毒性、GFR下降以及肾小管功能受损的标志；尿囊素是GFR的标志物；顺乌头酸盐是DKD的一个可能的生物标志物[32]。
2．蛋白质组学：
蛋白质组学研究显示，尿胶原蛋白片段在糖尿病患者出现MA之前的3~5年已经升高，因此它是DKD的一个很有希望的生物标志物[33]。另外，在2型DKD中，尿胎球蛋白-A被认为是患者出现MA和GFR下降的一个风险因素，提示其可成为预测DKD进展的候选标志物[34]。最近，外泌体的蛋白质组学也被认为是识别DKD新生物标志物的一种重要方法[35]。
3．基因组学：
DKD具有遗传易感性。但过去二十多年，无论是采用基因的连锁分析、候选基因还是全基因组关联分析，均未发现对DKD发病风险影响显著的基因。最近，肌肽酶D18S880微卫星多态性与高加索人的DKD易感性之间的联系被证实[36]。在另一项研究中，发现了CNDP1基因与DKD易感性相关[37]。这些基因的异常对DKD的作用尚需进一步验证。当然，随着研究的增加，类似相关的基因还在增加。
4．ncRNAs及外泌体：
ncRNAs包括微小RNA（micro RNA，miRNA）和长链ncRNAs。
miRNA含19~25个核苷酸，是内源性、非编码、单链的RNA转录本，主要作为基因表达的转录调控因子，与目标mRNA 3'未翻译区域结合。miRNA调节了大约60%的蛋白质编码基因的表达，而miRNA表达谱的改变可能与DKD病理过程有关。在DKD患者的血和尿中，已经检测到一些miRNAs的异常，某些肾脏特异性的miRNAs可作为早期DKD的标志物，甚至可能作为治疗靶标。Pezzolesi等[38]对7~20年的前瞻性T1DM队列中的DKD非进展者和快速进展者进行了研究，通过检测血浆中的5个miRNAs，发现let-7c-5p和miR-29a-3p对肾脏有保护作用，而let-7b-5p和miR-21-5p则与ESRD的风险增加有关。
长链ncRNAs的大小可变，但高度稳定，易于测量。有研究发现浆细胞瘤转位子1可映射5个miRNAs，调节TGF-β信号通路，使其成为预测T2DM患者ESRD的候选基因[39]。尿外泌体是由几乎所有类型的肾细胞释放的小囊泡。它们包含胞质、膜、转运蛋白和核酸，也可以作为miRNA或长链ncRNA的载体。因此，它们可能会提供潜在的DKD生物标志物。
综上所述，虽然MA作为早期诊断DKD及预测其进展的标志物的特异性和灵敏性受到质疑，但前述的生物标志物尚无一个被推荐用于临床。其可能的原因是：一方面，这些标志物有些来源于动物模型，有些仅在横断面/队列的小样本研究中被发现，而且结果还不完全一致；另一方面，队列研究随访的时间不够长；并且多采用尿白蛋白的严重程度定义肾病的进展，而不是肾脏疾病的硬终点进行研究。此外，DKD本身的病因和发病机制复杂，涉及遗传、血流动力学、代谢和环境因素的参与，如高血糖、血脂异常、高血压、肾素-血管紧张素系统激活、炎症浸润、生长因子和促炎因子增加、细胞内主要信号通路和转录因子激活等。因此，今后需要采用ESRD、肾脏替代或者移植治疗作为主要终点，使用代表DKD不同作用机制的一组生物标志物，设计类似"UKPDS、DCCT及其随访研究"的样本量较大、随访时间长的队列研究，进一步验证前述标志物或者新的标志物，才有望发现优于MA、理想的DKD标志物。相信随着多种组学等研究手段的快速发展和广泛应用，加之学者们探求DKD生物标志物的兴趣持续高涨，将来定会找出灵敏性和特异性高、临床实用、检测方便的一个或者一组生物标志物来识别发生DKD以及DKD进展的高危人群，从而有效预防和延缓DKD的发生、发展。
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