实验专栏丨miRNA表达谱分析,你怎么做?

2023-05-10 14:56:27

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科研工具作图| 实验 SCI |统计分析


实验目的


miRNA测序是指某个物种或特定细胞在某一生理功能状态下,细胞内所有转录的miRNA产物的集合,包含了时间和空间的限定,是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的必然纽带。miRNA转录水平的调控是目前研究最多的,也是生物体最重要的调控方式。应用高通量技术进行转录组测序是一种快捷可靠的获取转录组信息的方法。提供miRNA的转录本表达分析,其精确的计数方法更可对基因进行精确的定量分析。


miRNA测序的优点


● 高灵敏度:理论上可以检测单个细胞中一个拷贝的miRNA;

● 高精度:可以检测miRNA单个碱基的差异;

● 不受先验信息的干扰,既能鉴定已知miRNA,又有能力发现新的miRNA;

● 保留定向信息,用于链特异的表达分析;

● 利用Barcode在单次运行中经济地分析多个样品。


miRNA测序的数据分析:



1.长度分布统计


对获得序列的分子长度和数量进行统计分析,结果显示出该动物small RNA的特征分布,大量分子长度集中在22 nt附近。长度分布统计可用于验证实验的可靠性。



2.miRNA比对注释统计


将测序得到的序列与miRBase数据库,已知rRNA、tRNA、重复区、RefSeq数据库,以及其它非编码数据库如ncRNA、piRNA、Rfam数据库比对,对已知miRNA进行注释。


3.预测新的miRNA


miRNA前体的标志性发夹结构能够用来预测新的microRNA。将测序得到的序列比对到该物种的基因组后,截取附近区域的一段序列,通过折叠模型分析,如发现该序列位于茎环结构上,则初步判定该序列为一个候选的新miRNA。


4.miRNA表达模式分析


根据研究需要,选择目标miRNA分子进行表达模式分析。


5.样本间miRNA差异表达分析


利用统计学方法对不同样品间的miRNA表达差异进行分析。



6.差异miRNA表达模式聚类分析


可以对组间差异表达的miRNA与样本进行聚类分析后绘制热图(heat map)。用以研究每个miRNA在不同样本间的表达情况,同时也可对样本的分组情况进行验证。



7.miRNA靶基因预测


采用TargetScan、miRanda等生物信息学软件,对miRNA的可能靶基因进行预测。



8.靶基因GO功能显著性富集分析


通过GO富集分析将差异miRNA的靶基因按照不同的功能进行归类,达到对基因进行注释和分类的目的。


9.靶基因Pathway显著性富集分析


将差异表达的miRNA靶基因进行KEGG富集分析,可以把差异显著的pathway进行富集,有助于找到实验条件下显著性差异变化的生物学调控通路。


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