单细胞水平上的结直肠癌内肿瘤多样化

   最近《NATURE》发表了一片ARTICLE。从同一肠癌的多个单细胞中获取永生细胞系，并与同一个体同组织的正常细胞比较，以全面、系统、综合地探索肿瘤内的多样分化情况。

    作者从三个未经治疗的个体（P1，P2和P3）获得正常肠组织块，并将结肠直肠癌切成4-6块。从每一块的细胞液中获得类器官培养物，并提取单克隆细胞。进行已知癌症基因编码区测序或全基因组测序。并提取突变signature并估计每个signature对系统发育树的每个片段的贡献（signature1，5，6，17，18，20以及未知signature）。 

   在来自三名患者的正常结肠上皮的克隆类器官中没有观察到驱动突变或MLH1甲基化。

   P1树干中BRAF（V600E），PIK3CA（E81K）和ACVR2A（蛋白质截短小indel）中可能的驱动突变。PTEN和RNF43中可能存在仅限于树分支子集的驱动截短突变。

    在P2中，癌症干细胞中存在两种蛋白质截短的APC突变和一种纯合剪接位点TP53突变。

   P3中，KRAS突变（A146T）和两个截短的APC突变存在于癌症干细胞中，并且TP53框内缺失存在于一部分分支中。

    singnature在三个癌症的进化树中的作用不同。P1中突变主要是signatures 6, 20, 26 and indels。P2中主要是, signatures 5, 17, 18, and indels;  P3中是 signatures 5, 18, indels 和一种新的signature。

   每个癌症类器官组织中的signature1突变比同个体的正常类器官中的更多。假设在肿瘤细胞增殖过程中，正常细胞中特征1突变数目和有丝分裂数目之间的类时钟相关性维持在相同的速率，那么估计P1的癌细胞经历了1.9（±0.5）（SD ）倍于正常细胞的倍数，P2癌细胞2.5倍（±0.2）倍，P3癌细胞1.7倍（±0.2）倍。癌症细胞中signature1突变增加的另一种解释是癌细胞中DNA甲基化增加。在系统发生树的远端分支（即癌症分化最近阶段），每个有丝分裂的碱基置换突变率显着增加，P1（存在DNA错配修复缺陷）估计为正常的100倍，P2和P3（DNA错配修复完善）中的10倍。因此，假设对这些以往有丝分裂的估计是正确的，碱基置换，indel和基因组重排突变率随时间的增加也能代表每个有丝分裂中的突变率增加。

a，碱基置换的比较。P1,P2,P3正常细胞系中3792，3172，3621。癌症中72398，22291，14209。

b，小插入缺失和基因组重排的数量也有很大差异。P1,P2,P3正常细胞系中indel平均值227，130，167。癌症克隆中平均为27893，1485，2021。

c，自正常结直肠上皮细胞的克隆类器官与癌症衍生的克隆类器官的基因重排平均值形成鲜明对比，P1,P2,P3=71,176,67

大多数肿瘤细胞的额外突变负荷，是在肿瘤进化树的分枝，而非树干获得的，因此是在癌细胞群中的最近的显性克隆扩增之后发生的。

    表观遗传学改变可能是引起肿瘤内细胞群的生物多样性的一部分原因。作者检测了正常和肿瘤来源克隆类器官中470,000个CpG位点的甲基化状态。

a，主成分分析中，P1,P2,P3的正常干细胞聚集在一处，但各个癌细胞分散（P3两种TP53WT）。不同个体的正常结直肠干细胞的甲基化状态相对相似，但来自不同个体的肿瘤已经发展出不同的外生状态。

b，RNA-seq。基因表达谱聚类与甲基化聚类相关性很好，所有个体的正常类器官聚集在一起，而每个癌症存在单独的聚类

c，每种癌症的甲基化／突变／表达树。以突变树为基础的甲基化、表达树的结构显著相似。因此，在每种癌症中都有多样化的甲基化和转录组状态，并且这是可遗传的，稳定的并且独立于肿瘤微环境，因为它在体外培养器官类型后持续存在。

即使来自同一肿瘤的不同块类器官，对化疗／靶向治疗的IC50都有高达1000倍的差异。与其他P2.T4克隆相比，P2.T4.1显示出对SN-38的显着抗性，而P3.T1.5显示出与来自该个体的所有其他克隆相比对5-FU的不同敏感性。