—————— 摘 要 ——————
我们之前报告过，microRNA（miR）-29b具有肿瘤抑制的作用，但在急性髓细胞白血病中微小RNA（miR）-29b表达会下调研究者对AML中miR-29b表达下调的发生机制知之甚少。本文中我们将筛查能影响miR-29b表达的基因突变。利用桑格测序（双脱氧测序法），我们在16%的AML患者中鉴别出miR-29b-1/miR-29a簇前体内一个种系的胸苷（T）碱基缺失。尤其是我们发现新诊断的AML患者（n=61/303；20%）相对于年龄、性别和种族匹配的对照组（n=43/402；11%，p＜0.01）而言核心结合因子内miR-9多态性特征十分显著。这种多态性通过抑制miR-29a的加工影响成熟miR-29b和miR-29a的表达率。RNA免疫沉淀反应试验显示与对照组相比DROSHA的结合能力下降。最后我们发现这种多态性会对miR-29b-1/miR-29a累积到目标MCL-1和CDK6（二者均为miR-29的目标）的能力产生不利影响。
—————— 简 介 ——————
急性髓细胞白血病（AML）是造血系统的一种具有高度异质性的恶性疾病，其特征是骨髓（BM）和外周血（PB）中未成熟的血液原始细胞的克隆积累。大约55 - 60%的AML患者遗传物质发生了结构改变，包括基因缺失、染色体倒位和易位。在很大程度上这些改变代表了导致恶性转化形成和促成事件。细胞遗传学正常（CN-AML）的AML患者约占新诊断AML案例的30%-50%，在导致临床结局出现显著异质性的分子水平方面也显示出明显的差异。
在过去的十年中发现，一种名为microRNAs（miRNAs）的新型小型非编码RNA可以通过与蛋白编码基因的目标mRNA结合、抑制蛋白转译、和/或导致RNA降解，来调控基因表达。我们发现miRNA的失调以及它们靶基因的改变，可以通过干扰或参与细胞关键时期（如发育、分化、增殖和凋亡）蛋白的表达，促进多种人类实体肿瘤和血液恶性肿瘤的恶性转化。我们和其他人阐述了与AML的基因和分子亚组有关的独一无二的miRNA表达特征。AML中表达失调的miRNA里，我们关注miR-29家族成员的原因如下：首先，miR-29家族由3个排列成2个簇的亚型组成（待斟酌）：miR-29b-1/miR-29a位于染色体7q32和miR-29b-2/miR-29c位于染色体1q23。有趣的是，染色体7q32是在骨髓增生异常综合征(MDS)和治疗相关的AML中经常缺失的区域。第二，miR-29家族成员在一些癌症如高风险慢性淋巴细胞白血病（CLL）、肺癌、侵袭性乳腺癌、胆管癌和横纹肌肉瘤等中表达下调。第三，miR-29b在存在野生型人磷酸蛋白（NPM1）、c-KIT突变的核心结合因子（CBF）和单染色体7或del7q和t（11q23）的CN-AML患者中表达下调。第四，AML细胞系miR-29b表达的恢复和原发性AML中原始细胞诱导凋亡，并显著降低白血病模型中异种移植的致瘤性。我们还发现，miR-29b是调节白血病细胞DNA甲基化和酪氨酸激酶受体活性的核心。总之，这些研究证据支持miR-29b在AML中有肿瘤抑制功能。
但是，除了染色体7被删除的AML案例外，我们对miR-29b在AML中表达下调的机制知之甚少。由于突变可以导致miRNA表达的丧失，在本文中我们筛查了AML患者的样品寻找能影响miR-29b表达和功能的突变。
—————— 结 果 ——————
miR-29b-1/miR-29a簇前体的胸腺嘧啶核苷（T）碱基缺失多态性在AML核心结合因子中集中出现
为了筛查可能影响miR-29b表达的突变，我们筛查了100份有代表性的原发性AML患者样品（患者特征见表1）中位于染色体7q32全miR-29b-1/miR-29a簇（包括位于miR-29b-1的5’和miR-29a前体3’的200个碱基对（bp），见图1A）基因组DNA区域。
我们关注这个簇是因为它位于一个在血液恶性肿瘤(包括AML)中经常被删除和发生突变的脆弱基因组区域。利用桑格测序我们确认100名患者中的16名（16%）（染色体7:130,877,074T缺失）的miR-29b-1 / miR-29a簇前体miRNA（染色体7q32miR-29b前体3’的-385bp和miR-29a的5’-264bp）内缺失（T）碱基（图1B）。此缺失与dbSNP数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/）中相同位置（rs67760566）正（+）链描述的一个碱基缺失相同。在3/10 inv（16）和7/62 CN-AML患者中也观察到该T碱基缺失，其余6例分布于复杂核型（CK）（2/11）、分离的-7（1/5）、11q23（1/4）和其他细胞遗传学（2/5）中。在大多数情况下，T碱基缺失是杂合的（n=14），而在与CK相关的分离的单体7和-7的情况下，其余等位基因都发生T碱基缺失。为了研究这一基因组发现是否为体细胞或种系，我们使用了两名患者的颊黏膜DNA对同一基因组区域进行了测序，这两名患者被认为呈T碱基缺失阳性。经证实在这两种情况下，我们观察到了相同的杂合T碱基缺失，支持其源于种系（未显示的数据）。为了调查这种异常在健康人群中出现的频率，我们利用与MD安德森白血病对照组性别和种族相似的402名健康个体（西班牙裔白人除外，该人群在MD安德森人群中更为常见（n=14/100 vs. OSU健康对照组（n=29/402），P=0.04）的PB单核细胞中获取的基因组DNA，仅仅对观测到T碱基缺失（大约200bp）的区域进行测序。我们发现健康人群的这种多态性的频率为11%（43/402例）（38例杂合子和5例纯合子）。根据种族或性别，这种多态性的频率没有差异。AML病例（n=100:16%）和对照组（n=402:11%，P=0.16）的miR-29多态性的频率没有显著不同。虽然没有统计学意义，但我们发现与对照组相比（n=43/402:11%），患有CBF白血病的AML病例的miR-29多态性程度更高（n=3/12:25%）（图1C）。为了进一步研究这一发现，我们在更大的第二人群中筛查这种多态性是否存在，第二人群包括303份新诊断AML患者的样品，这些患者存在t（8；21）（n=131）和inv（16）（n=172），来自CALGB/联合白血病组织库（患者特征见表2和表3）。在性别和种族相似的前提下，CBF白血病患者的多态性频率（61/303,20%）显著高于健康对照组（43/202，11%）（P＜0.01）（表2和图1C）。61名存在多态性的CBF-AML患者中仅有8名为纯合子类型。存在或不存在多态性的inv（16）和t（8;21）的患者的基线临床特征没有显著差别，但是t（8;21）AML案例的年龄（多态性中值45 vs. 非多态性中值37，P=0.04），种族（多态性白种人n=17（61%）vs. 无多态性白种人n=91（90%）（P＜0.01））；血小板计数（多态性中值47×109L vs. 中无多态性值36×109L，P=0.03）以及外周血胚细胞百分比（多态性中值28 vs. 无多态性中值39，P=0.04）。
图1 . 急性髓细胞白血病（ A M L ） 患者胸苷（ T ） 碱基（rs67760466）缺失的频率。
（A）miR-29簇和T碱基缺失位置的图示。
（B）野生型（WT）和多态性案例的色谱图。
（C）AML患者和对照组多态性（rs67760466）的频率。使用费舍尔精确检验获得P值，患者特征见表1和表2。
表1. 安德森癌症中心人群的患者特征
表2. CALGB/联合人群和对照组的患者特征和结果
CBF白血病中miR-29b多态性的预后影响
为了研究这种多态性是否对CBF-AML产生任何预后影响，我们根据利用重新出现inv（16）（n=126）和t（8;21）（n=100）的AML患者（这些患者参与CALGB/联合试验使用加强型阿糖孢苷/蒽环霉素一线疗法治疗，临床随访信息可用）亚组的miR-29多态性特征评估了全响应（CR）频率、无事件存活（EFS）和总体存活情况（OS）。
首先我们研究了这些多态性的存在是否预示着会诱导化疗出现反应。据我们观察：存在或不存在多态性的患者的CR率没有任何差别；存在miR-29多态性的t（8；21）案例的CR反应率（n=19）为90%，不存在miR-29多态性的t案例（n=76）的CR反应率为96%（p=0.28）；存在miR-29的inv（16）案例（n=25）的反应率为100%。而无miR-29多态性的inv（16）案例（n=98）的反应率为97%（P=1.00）。同样，存在或不存在miR-29多态性的CBF患者的EFS或OS之间也没有显著的统计学差异。考虑到高风险CBF白血病患者可能存在c-KIT突变，故保留了这些结果。
T碱基缺失多态性影响miR-29b-1/miR-29a簇的加工
为了研究这种多态性是否影响miR-29b或miR-29a的成熟表达，我们测量了100份原发AML样品（MD Anderson数据集）中45份样品的miR-29b和miR-29a表达，这45份样品的RNA也可测量。虽然与T样品（n=35）比较，存在多态性的样品（n=10）的成熟miR-29a和miR-29b水平没有显著差异。但是我们观察到存在多态性的样品的miR-29a/miR-29b率比WT样品低得多（23.2%比43.5%，P=0.02，t检验）（图2A）。这些结果表明多态性改变了miRNA簇的加工。为了确认这一结果的可能性，我们将1个存在多态性患者的miR-29b-1/miR-29a克隆到p-Retro超级质粒并转染为K562细胞（内源性miR-29表达水平非常低）和WT（没有多态性的miR-29b-1/miR-29a）和空载体结构。转染后的24小时和48小时后执行RNA印迹法揭示miR-29a前体的积累，而在48小时和72小时的时间点，成熟miR-29a水平下降了2倍（图2b）。虽然miR-29b前体水平在转染后24小时和48小时升高，但是在所有时间点，成熟miR-29b水平没有变化（直到72小时）。总而言之，这些数据支持多态性影响miR-29a的加工。假设primiR-29b-1/miR-29a初级转录过程需要Drosha复合物，我们利用经过miR-29b-1/miR-29a多态性、miR-29b-1/miR-29a WT或空载体结构转染的K562细胞执行RIP试验评估DROSHA复合物和primiR-29b-1/miR-29a之间的相互作用效果。如图2C所示，与WT比较时，多态性降低了Drosha的结合能力。
图2. 急性髓细胞白血病T碱基缺失多态性影响的miR-29b-1/miR-29a簇加工。
（A）定量实时PCR测量的野生型（WT）和存在多态性（poly）的案例的miR-29b-1/miR-29a的表达率。
（B）空载体（WV）、WT或Poly结构转染后miR-29b-1/miR-29a的RNA印迹法（NB）。U6用作加载控制。
（C）使用miR-29b-1/miR-29a poly、WT或EV结构转染的K562细胞系的RNA免疫沉积试验。
多态性限制miR-29b-1/miR-29a簇的靶向效果和肿瘤抑制功能
为了评估该多态性是否影响miR-29靶向效果，我们共转染了包含两个已知miR-29目标的致癌基因的3’端非转译区（3’UTR）的报告荧光素酶结构，经WT、空载体和具有miR-29b-1/miR-29a簇的多态性转染的MCL-1和CDK6并执行荧光酶试验。有趣的是，相对正常的荧光素酶活性受多态性簇的抑制程度低于WT构造的MCL-1（相对低减WT：63%，多态性：80%，P=0.02，t检验）（图3A）和CDK6（相对低减WT：37%，多态性：68%，P＜0.01，t检验）（图3B）。接下来，我们研究了荧光素酶试验中观察到的效果是否被转译成蛋白质水平。事实上，我们发现异常WT簇过表达引起的MCL-1和CDK6蛋白的下调程度高于存在多态性的簇（图3C和3D）。最后，我们研究了由多态性导致的MCL-1蛋白表达较低的效果下降程度是否在功能上具有重要性。由于MCL-1是一种抗凋亡蛋白，我们比较了K562细胞系中WT和多态性miR-29b-1/miR-29a簇过度表达的凋亡诱导作用。我们发现miR-29b-1/miR-29a簇凋亡率低于WT对照组（空载体），图3E。
—————— 讨 论 ——————
我们的结果鉴别出miR-29b-1/miR-29-a c簇的种系多态性，与正常人群相比CBF-AML患者亚组的多态性频率升高。在第二大独立人群对照组中（303名复发CBF-AML患者，包括inv（16）和t（8；21））进一步确认了这一结果。该AML人群多态性频率升高的原因未知。有趣的是，miR-29b通过直接靶定c-KIT致癌基因的激活因子sp1抑制c-KIT致癌基因转录，在CBF白血病的c-KIT致癌基因表达调节中发挥关键作用。miR-29b在CBF细胞系和小鼠AML模型中异常的过表达抑制了c-KIT的表达并诱导细胞死亡。miR-29多态性在CBF白血病患者中更常见的事实进一步支持了miR-29在CBF白血病中发挥重要功能作用的观点。
图3. 多态性抑制miR-29b-1/miR-29a簇的靶向效果和肿瘤抑制功能。
（A）MCL-1和（B）CDK6的荧光素酶试验。使用包含MCL-1或CDK6的3’未转染区域的荧光素酶报告基因MiR-29b-1/
miR-29a野生型（WT）、多态性（poly）或空载体（EV）结构。结果显示为使用海肾荧光素酶标准化后与EV的相对
荧光素酶值。使用miR-29b-1/miR-29a WT，Poly或EV结构转染后的K562细胞的（C）MCL-1和（D）CDK6蛋白的免疫
印迹法。GAPDH用作加载控制。作为质控品，我们使用乱序（SC）或miR-29b（29b）寡核苷酸转染了细胞。（E）经
miR-29b-1/miR-29a WT，Poly 或EV结构转染后的K562细胞内使用膜联蛋白V/碘化丙啶染色测量的凋亡。
我们工作中的另一个有趣的发现是存在独立染色体7单体（1/6）的患者也具有这一多态性。如前所述携带单体7和del7q原发AML原始细胞的患者与不存在染色体7异常的AML患者相比miR-29b表达水平较低，表明结构性基因组缺失是miRNA表达水平下降的原因，因为这个簇位于染色体7q32。存在单体7的AML患者的其他等位基因中，该簇的功能和表达也受多态性影响，并有助于进一步削弱miR-29b簇的肿瘤抑制功能。
多态性通过抑制miR-29a的加工影响成熟miR-29b和miR-29a的表达率。RNA印迹法显示与成熟miR-29a表达水平下降相关的miR-29b前体发生累积。但是WT对照组的成熟miR-29b水平并未发生变化。有趣的是，多态性会在miR-29b-1和miR-29a之间以及在miR-29b转录发生后出现，这可能是多态性不能影响成熟miR-29b的原因。出现成熟miR-29a表达水平下降时，miR-29a前体的积聚表明miRNA加工存在为题。根据之前研究的结果，我们认为前体miRNA的突变和多态性能影响miRNA的加工并导致前体累积和成熟miRNA的表达水平下降。尤其是在存在多态性的前提下，该缺失位于miRNA前体之外，这表明2种miRNA之间的基因组区域对该簇内成熟的miRNA中的一种miRNA的处理非常重要。
我们在原发AML样本中确认了实验研究发现的多态性导致的miR-29a和miR-29b之间的畸变率。该发现带来了该簇内成员的不同表达水平对正常生理和病例情况下对miR-29功能的作用和显著性的问题。我们之前发现原发AML样本中与miR-29a或miR-29b表达相关的基因表达显著不同，这表明AML中miR-29a和miR-29b的功能并不重叠。很有可能成熟miR-29a和miR-29b的表达之间存在微妙平衡，这二者之间的表达率的变化可能影响这两种miRNA的功能。多态性对该簇靶定致癌基因MCL-1和CDK6（二者均为miR-29的目标）的能力产生的负面影响支持了这一观点。
总之，我们发现CBF-AML病例的miR-29b-1/miR-29a之间大多具有多态性。多态性影响miR-29-1/miR-29a簇的加工，导致前体累积和成熟miR-29a表达水平低。从功能上说，多态性影响该簇靶定MCL-11和CDK6和诱导凋亡的能力。
—————— 材料和方法 ——————
患者样本
安德森癌症中心组织库（n=100）以及自癌症和白血病B组(CALGB)/联合白血病组织库（n=303）的成人AML患者中获得冷冻的BM或（PB）样品。诊断时利用非刺激短期培养（24- 48-72小时），联合或不联合直接方法或G显带方法对样本进行细胞遗传学分析。对于CALGB/联合数据集，由CALGB批准的机构细胞遗传学实验室（细胞遗传学伴随研究8461的部分）在诊断时执行细胞遗传学分析并由进行中心染色体核型审核确认。细胞遗传学克隆的标准以及染色体组型的叙述遵照人体细胞遗传学术语国际体系的建议。如前所述利用桑格测序对大部分样品执行FLT3-ITD、FLT3活化环D835和NPM1突变分析。所有患者均获得知情同意书，用于分子研究的样品均低温贮藏。俄亥俄州立大学和安德森癌症中心机构审查委员会批准了该研究。从俄亥俄州立大学人类遗传学样品库的402名健康对照组受试者的血液中获得DNA。
突变筛查
为了筛查突变和多态性，利用Applied Biosystems DNA测序系统对原发AML样品的整个基因组区域、位于染色体7q32的miR-29b-1/miR-29a相应的簇前体，包括5’和3’的200bp碱基都进行了扩增和测序。发现正常序列的偏差后，筛查402名健康对照组受试者血液的一系列DNA鉴别多态性。
miR和目标基因的实时定量
利用PCR 9700 Thermocycler ABI Prism 7900HT并使用单试管TaqMan miRNA试验定量检测成熟miR-29a和miR-29b表达。为了检测髓细胞白血病序列1（MCL-1）和周期蛋白依赖性激酶6（CDK6）的mRNA水平，我们利用了TaqMan基因表达分析。使用18s和U6完成标准化。一式三份执行综合实时PCR包括无模板对照组。使用comparative Ct法计算相关表达。
miRNA表达载体的细胞转染和miRNA前体
源于野生型（WT）或存在多态性的患者的miR-29b-1/miR-29a簇（前体前后200bp）相应基因组区域被克隆为pSuperRetro表达载体。miRNA前体miR-29b于Ambion采购。使用AMAXA以及5μg载体pSuperRetro miR-29b-1/miR-29a-多态性和空载体，或使用5μg前体寡核苷酸（miR-29b或乱序质控品）对500万K562细胞（ATCC，Manassas，VA）进行核穿孔（nucleoporated），总量为10ml。
RNA印迹法
如前所述执行RNA印迹法。简而言之，使用Trizol试剂提取总RNA。在12%的聚神经酰胺变性预制凝胶上运行RNA样品（10μg），接着在Hybond膜上进行转染。使用α-32p miR-29a和miR-29b标记的探针在42℃的环境下隔夜处理执行杂交。miR-29探针序列被补足为miR-29S。加载质控品时我们在去除过滤器后测量了U6表达。
RNA免疫沉淀试验（RIP）
根据厂商说明书使用Magna RIP试剂盒执行RIP。使用载体pSuperRetromiR-29a-1/miR-29b-WT，pSurperRetro-miR-29a-1/miR-29b-多态性和空载体转染的细胞被裂解，使用Drosha抗体类别号A301-886A免疫沉淀法提取与RNA相联的蛋白。RNA通过按照试剂盒提供的说明从Drosha免疫沉淀复合物中提取出来，并使用Nanodrop2000定量。使用High Capacity cDNA Reverse Transcription试剂盒逆转录总RNA（25ng）。使用定量实时PCR评估primiR-29b-1/miR-29a外源表达并参考非免疫沉淀的质控品，该过程使用下列引物：primiR-29a1/miR-29b Fwd: 5’- CAT ATA TCA CAA ATG GCA GTC AGG TCT -3’and Rev: 5’- TGT ACA GGA TAT CGC ATT GTT GGA A-3’。使用Applied Biosystems 7500设备执行实时PCR。使用Ct（阈值循环数）测量miRNA表达。
统计分析
利用Fisher的精确测试和t检验比较两组患者的基线特征和平均miRNA表达。这些报告的P值左右相称，使用SPSS软件包（SPSS 10.0）获得。使用威尔科克森秩和检验及费舍尔精确检验处理连续和分类变量比较联合/CALGB人群和对照组存在多态性和不存在多态性的人群的基线人口统计学、临床和分子特征。使用Kaplan-Meier方法计算无事件存活（EFS）和总存活（OS）率并通过对数秩检验评估存活分布的差异。出了临床终点定义见补充数据。联合统计和数据中心使用SAS 9.4 and TIBCO Spotfire S+ 8.2并基于2016年6月16号锁定的数据库执行所有统计分析。
荧光素酶报告实验
使用来自基因组DNA的PCR扩增源于MCL-1、包含miR-29b目标位点的3’UTR并立即使用来自荧光素酶终止密码子的XBA1位点插入PGLYMO3控制载体。利用下列引物组生成特殊片段：MCL-1 FW 5’TGGAACTCATT AGCTGTGTGC3’和RW 5’GATGCCAATGCAAAAACTTG 3’。我们还利用Quagen XL site directed Mutagenesis试剂盒，从完美补充的位点生成一个缺失4bp的插入物。通过测序确认野生型和突变插入物。在10%胎牛血清在RPMI-1640内让人体细胞系K562增殖。根据厂商的协议利用5μg萤火虫荧光素酶报告载体和0.5μg包含海肾荧光素酶、pRL-TK以及5μgpSuperRetro-miR-29a-1/miR-29b-WT，pSurperRetro miR-29a-1/miR-29b-多态性或空载体在10ml微孔板上共转染这些细胞。转染后24小时连续使用双荧光素酶试验测量萤火虫和海肾荧光素酶活性。
凋亡试验
使用pSuperRetro表达载体进行核穿孔后的不同时间点执行膜联蛋白V/碘化丙啶染色。
免疫印迹法
利用RIPA缓冲液对从被pSuperRetro表达载体转染的K562细胞系中提取的总蛋白进行提取。利用MCL-1、CDK6和GAPDH并采用免疫以及发分析蛋白表达。
摘自《Oncotarget》，版权归其所有，仅供内部参考。
编译：张凯
审校：姜妤 魏冰
表3. CALGB/联合人群（8;21）and inv（16）AML患者由多态性分类的临床和分子特征