操作流程:
原料:低温脱脂豆粕(禹王)
方法:碱溶酸沉法
操作步骤:
1:粉碎豆粕
将豆粕放入粉碎机粉碎成粉末状,做好标记,密封。
2:制备溶液
①2mol/L的氢氧化钠:80g氢氧化钠+1000mL水
注意:氢氧化钠溶于水会放出大量的热,冷却后在放入广口瓶中保存。
②2mol/L的盐酸:116.8ml浓盐酸+1000mL水
3:碱溶
40g豆粕粉末加入400毫升(10倍)蒸馏水,搅拌器室温下搅拌至少2h,期间维持溶液pH为8.0。随后纱布过滤取滤液。用冷冻离心机进行离心,8000rpm×20min。取上清液。
注意:期间pH计最好一直放在搅拌的溶液中,并且关注pH的变化,维持pH为8.0。纱布过滤时,尽量拧干纱布在丢掉滤渣,降低大豆分离蛋白的损失。离心前一定确保每个离心管的总重量相同,保持平衡,不然机器很容易因为不平衡而坏掉。
4:酸沉
离心过的上清液迅速调pH为4.5,4℃(冰箱)静置30min。随后进行6000rpm×15min的离心,取沉淀(白色有韧性),记下湿重。
注意:调pH尽可能的迅速,如果用酸量太大,可以增大盐酸溶液的浓度。静置时间一定要足够30min,也可以稍微长提点时间,等待溶液酸沉完全,静置后的溶液应该呈现淡黄色和白色的分层。取沉淀时,用小勺子完全挖出来后放入烧杯,并且称量。不可浪费与丢弃离心后的沉淀。
5:透析
在沉淀中加入7倍湿重的蒸馏水,用磁力搅拌器搅拌1-2个小时,维持pH为7.5。随后放入透析袋,透析48小时,每16小时换一次水。
注意:加水之前,可以用小勺子碾碎沉淀,随后加入一点点水,搅拌碾碎沉淀,然后在加入剩下的水进行缓慢搅拌,这样可以减少搅拌的时间,搅拌结束时,溶液呈现淡黄色微透明状态,没有白色颗粒或者絮状物。透析时要确保透析袋用夹子夹紧,不漏液,同时透析袋装的溶液上方留一定的空白方便透析,水深要莫过透析袋,保证其能够正常透析。
6:冻干
将透析后的溶液放入干净的培养皿中,盖上保鲜膜,用笔或者针扎出小孔,放入冰箱冻硬后放入冷冻干燥机干燥。干燥后,用小勺子刮出所有冻干的大豆分离蛋白,称重,密封保存。
注意:培养皿中的液体不宜太多,二分之一即可。一定冻硬以后在冻干,要不然液体冻干会因为压强而膨胀。
表征:得率,凝胶电泳,凯氏定氮,氮溶指数等。