桑叶提取物中黄酮和生物碱的降血糖功能显著，在医药和食品工业中应用广泛，目前市场上桑叶提取物的品种多、规格杂，影响市场的正常运行和发展， 制定桑叶提取物质量标准可以充分解决这个问题。 本论文主要以富含酮碱的桑叶提取物为对象，研究了黄酮和生物碱的检测 方法、同步提取工艺，在此基础上制定了桑叶提取物的质量标准，还研究了桑 叶总黄酮的纯化工艺。 （１）建立了桑叶黄酮类化合物的酸水解高效液相色谱检测法，并优化了酸 水解条件，所建立的检测方法稳定可靠，完全满足桑叶黄酮类化合物的检测要 （２）研究了桑叶黄酮类化合物及１一脱氧野尻霉素（ＤＮＪ）的同步高效提取工艺，优化后的提取工艺为：液料比为１０：ｌ，乙醇浓度为６０％（ｐＨ＝２），提取时 间为２ｈ，提取温度为８０，提取２次。总黄酮的提取率为８２．４％，ＤＮＪ的 提取率为７８．６％。 （３）研究了桑叶总黄酮的纯化工艺，最佳纯化工艺为：上样浓度为２．９３ ｍｇ／ｍＬ，上样ｐＨ为４，上样流速为２ＢＶ／ｈ，上样体积为４ＢＶ，总黄酮吸附后 用蒸馏水以２ＢＶ／ｈ的流速洗脱２ＢＹ，再用７０％乙醇以１ＢＶ／ｈ的流速洗脱， 收集洗脱液３ＢＶ后，减压蒸馏浓缩，烘干后得总黄酮含量为２１２．６９ ｍｇ／ｇ的精 （４）所制定的质量标准是：富含酮碱的桑叶提取物中，总黄酮的含量不少于５０ｍｇ／ｇ，ＤＮＪ的含量不少于１．５ｍｇ／ｇ。 关键词：桑叶提取物 质量标准 黄酮类化合物ＤＮＪ 纯化工艺 据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。
桑叶，又名“铁扇子”，是桑科桑属植物桑ＭｏｒｕｓｌｂａＬ．的叶子。本属植物全球约１６种，分布于北温带、亚洲热带和非洲热带及美洲地区。中国是桑 树的故乡，也是世界上主要的桑叶产地之一。桑属在中国已有４０００多年的栽培 历史，资源及其丰富，品种繁多，主要有：家桑或白桑（Ｍｏｒｕｓａｌｂａ）、鸡桑（Ｍ． ｕｓｔｒａｌｉｓ）、华桑（Ｍ．ｃａｔｈａｙａｎａ）、蒙桑（Ｍ．Ｍｏｎｇｏｌｉｃ）、山桑（Ｍ．ｄｉａｂｏｌｉａ）等ｌＯ多个 品种和变种，分布于中国大部分地区，以江苏、浙江、四川等地产量较大…。 桑叶中含有多种有效成分，主要有有黄酮类、生物碱类及糖类。其他还有 甾类、挥发油、氨基酸类、维生素和微量元素。具体成分如表１．１。 表１－１ 桑叶的主要化学成分及含量 Ｔａｂｌｅｌ１－１ Ｍａｉｎｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓａｎｄｃｏｎｔｅｎｔｏｆ Ｍｕｌｂｅｒｒｙ Ｌｅａｖｅｓ ２００５年药典中功标明桑叶具有疏散风热，清肺润燥，清肝明目的功能【８１， 用于风热感冒，肺热燥咳，头晕头痛，目赤昏花。其具有的药理作用和药效成 分如表１．２。 桑叶的药理作用及功效成分Ｔａｂｌｅ１－２ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓａｎｄｅｌｅｍｅｎｔｏｆ ＭｕｌｂｅｒｒｙＬｅａｖｅｓ 由上可知，在桑叶中，黄酮类化合物和生物碱是其中的主要成分，其中黄 酮类化合物占桑叶干重的１～３％，它具有降血糖、降血脂、抗炎及抗癌作用， 生物碱中的ＤＮＪ的含量虽然只占桑叶干重的０．１％，但其降血糖功效非常显著。 桑叶提取物则是桑叶经溶剂提取加工得到的具有相对明确药效的一种粉 末，该粉末呈淡黄色或黄褐色。 桑叶提取物的应用很广泛，目前市场上有很多桑叶提取物制成的复合制剂 及各种保健品，复合制剂有用于降血糖的桑叶多糖口服制剂和桑叶总碱制剂， 用于降血脂的有桑叶黄酮制剂和桑叶中风丸等。目前利用桑叶开发食品的研究 很多，有桑叶茶、桑叶汁饮料、桑叶面条、桑叶奶、桑叶果冻，还有桑叶排毒 养颜胶囊和桑叶护肤霜等。
１．１问题的提出 随着社会的发展，传统医学发挥着越来越大的作用，中药等天然药物在这 方面具有无可比拟的优势，使植物提取物和复方药物的开发成为新的选择。天 然药物会与化学药物、生物药物形成三足鼎立之势，对植物药的认可，营造了 巨大的天然植物产品市场。在国际市场上，天然健康品已占３０％份额，市场销 售额约２７０亿美元。 我国是中成药的生产大国，其数量和品种都是世界上任何其他国家不可比 的。据初步统计，，其 中有５０％以上的中药提取物没有国家药品标准。各药品生产企业在生产这些没 有国家药品标准的中药提取物时，按照各自制订的企业内定标准进行生产和检 验。各级药品监督管理部门很难对这些用于中药提取物生产的中药材（中药饮片） 的质量、生产过程的控制、最终产品的质量进行有效的监督，这就给我国中成 药的质量及公众用药安全有效带来一定隐患。 现阶段由于桑叶品种繁多、基原相近，以及地域、生态环境、栽培、加工 及储备养护等因素的影响，导致其品种混乱，质量差异很大。生产水平低、炮 制规范不统一，许多环节缺乏严格的工艺操作参数，质量尚无统一量化指标， 这些都影响了桑叶提取物内在质量的稳定，从而导致中药产品的质量不稳定， 因此建立稳定的、真正反映桑叶提取物的质量标准势在必行。 目前国内外对于桑叶的研究颇多，主要集中在黄酮和多糖方面，且主要关 于桑叶黄酮和多糖的检测、提取和分离，对于其特征功效成分一生物碱的研究 鲜有报道。迄今为止，只有２００５年版药典中规定了桑叶的质量标准，对于桑叶 提取物，目前仍未有任何文献来规定其质量标准。且２００５版药典中所制定的质 量标准仅以芦丁含量做为质量控制指标，并不完善，所以需要制定一个比较完 善的桑叶提取物的质量标准。 为此，在“十一五”国家科技支撑计划一医药领域项目（七）“中药产业区 域发展及特色产品研究开发一中，设立了“毫菊等中药提取物生产技术研究” 的研究子课题。本课题研究内容是该子课题的一部分，目标是解决安徽省内影 响中药产业发展的资源开发、质量控制、中药提取物生产质量方面的难点问题， 提升中药产业的科技水平。
１．２ 桑叶提取物的国内外研究现状 桑叶提取物中，黄酮类化合物和生物碱为主要功效成分，桑叶提取物具有 降血糖、降血脂、抗炎及抗癌等作用，这些药理作用跟桑叶黄酮、生物碱具有 很大关系。目前，桑叶黄酮化合物的国内外研究报道较多，而对于生物碱中的 主要功效成分ＤＮＪ，涉及的研究较少。
１．２．１ 黄酮类化合物的国内外研究现状 在桑叶提取物中，黄酮类化合物是其中最主要的有效成分，也是桑叶化学成分中研究最多，结构和成分比较明确的一类化合物。黄酮类化合物是以黄酮 （２一苯基色原酮）为母核，同时黄酮母核上连有羟基、甲氧基、氢氧基等取代基， 它们包括黄酮醇、黄酮、黄烷酮、黄烷醇、花色素、异黄酮、二氢黄酮醇以及 查尔酮等另外，还有一些其他类型的类黄酮，如香豆素等。 桑叶中总黄酮含量约占桑叶干重的１．０％～３．０％，主要为黄酮醇类，它们 大多以黄酮苷的形式存在，有芦丁、槲皮苷、异槲皮苷和紫云英苷等，其他还 有少量的黄酮苷元，如槲皮素和山奈酚等，其基本骨架如图１．１。 图１－１黄酮醇基本结构Ｆｉｇ．１－１ ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＦｌａｖｏｎｏｌｓ １．２．１．１ 黄酮类化合物的检测方法 （１）紫外分光光度法 黄酮类化合物中存在苯环等发色基团，对紫外有吸收，因此可利用紫外分 光光度计检测，该方法操作简单、时间短，但由于叶绿素和一些其他物质的干 扰，测定值往往偏高。 （２）可见光分光光度法 氯化铝显色法 黄酮类化合物分子中羟基或羰基均可以与氯化铝在醇溶液中形成稳定黄 色铝络合物，在４２０ｒｉｍ有特定吸收，该黄色的深浅与黄酮量呈一定比例关系， 可比色定量。杨普香等用该法测定桑叶茶黄酮类化合物，张传部用该法检 测了桑叶及其保健饮料中总黄酮的含量等。该方法特点为操作比较简单，且对 于仪器要求不高，但显色法比较粗糙，不够精确，且易受桑叶黄酮中各种物质 产生的吸收峰互相的干扰，其测量结果不精确。 亚硝酸钠．硝酸铝显色法 黄酮苷在氧化剂亚硝酸盐存在的情况下，与硝酸铝生成黄色的黄酮铝络合 物，在碱性环境下显红色，在５１０ｎｍ波长处有吸收峰，且符合定量分析的比尔 定律，因此可用可见分光光度计检测。孙敏耀、杨虎均采用该法测定 桑叶总黄酮，该方法操作比较简便，但检测易受其他物质的干扰，测量结果亦 不精确。 差示分光光度法具有自动扣除原花色素、叶绿素等干扰，且不受底液混浊的影响等特点，程亚倩等研究了双波长吸光光度法测定银杏叶植物中黄酮含 量的方法，测得的总黄酮含量均比比色法低，主要原因是双波长能很好地扣除 背景，结果准确，精密度好。康旭珍研究了差示分光光度法测定桑叶中总黄 酮含量的方法，其结果真实准确、重现性好，是一种较好的桑叶品质控制检测 方法。 （３）ＨＰＬＣ法 近年来ＨＰＬＣ法逐渐被运用到桑叶黄酮类化合物的检测中，该法比较精确， 可以准确定量，刘丽芳等用ＨＰＬＣ法测定桑叶中芦丁和槲皮苷的含量，艾国 民等用ＨＰＬＣ法测定马桑叶中游离的槲皮素和山奈酚。范斌等利用ＨＰＬＣ 测定桑叶中槲皮素．３，７．二氧葡萄糖苷的含量。但由于桑叶总黄酮中黄酮苷和 苷元成分非常复杂，而ＨＰＬＣ法只能同时检测某几个特定的黄酮苷或苷元，无法 同时检测总黄酮，若将所有黄酮苷和苷元逐个分开进行检测又太繁杂，因此该 方法具有一定的局限性。 （４）毛细管电泳法 毛细管电泳技术是一种高效分离分析技术，它具有灵敏度高、柱效高、分 析速度快、所需样品量少、溶剂消耗少和抗污染能力强等优点，在中药有效成 分分析方面显示出良好效果。孙莲等用该法测定了桑叶中的芦丁和槲皮 素，在特定的电泳条件下，两种目标组分在１２ｒａｉｎ内完全分离。 （５）超临界流体色谱法 近年来，超临界流体色谱法在国际上发展很快，但在我国还处于探索阶段。 ，并考察了流 动相的组成、温度和压力对色谱分离的影响，以Ｃ１８为固定相，二氧化碳．０．０５％ 三氟乙酸的乙醇溶液（１０：１）为流动相，二者获得良好的分离，这种方法定量结果 准确，重现性好。 除了以上介绍的测定方法外，还有荧光光度法、气相色谱法等。由于多数 黄酮类化合物的沸点较高，难于气化，需要将样品衍生化后检测，使得气相色 谱法很繁琐，应用不普遍。薄层色谱法分析时间长，精确性及重现性较差，一 般也不用于定量检测。目前应用最广的是亚硝酸钠．硝酸铝显色法和高效液相色 １．２．１．２黄酮类化合物的提取方法在桑叶中，黄酮类化合物一般以黄酮苷的形式存在，此外还有一小部分游 离苷元。黄酮苷类及极性稍大的苷元，一般可用乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、 水或某些极性较大的混合溶剂进行提取，其中用得最多的是甲醇．水、甲醇或乙 醇．水。大多数黄酮苷元则宜用极性较小的溶剂，如、氯仿、乙酸乙酯等提 取，多甲氧基黄酮类苷元，甚至可用苯来提取。 目前，黄酮类化合物的提取方法主要有：溶剂提取法、超声萃取法、微波 提取法、超临界流体萃取法等。 （１）溶剂提取法 溶剂提取法是目前国内外使用最广泛的提取方法，包括水提法、碱提酸沉 法和有机溶剂提取法。 水提法 水提法只限于黄酮苷类，如提取芸香苷等。由于热水浸提时易溶于水的杂 质（如蛋白质、鞣质、淀粉、多糖类化合物等）较多，后处理较复杂，提取效率 也不高，故不常使用。 由于黄酮类成分大多具有酚羟基，因此可用碱性水或碱性稀醇浸出，浸出液经酸化后析出类黄酮化合物。在实际生产中应用较广泛，具有经济、安全， 方便等优点，但该法产生的杂质较多，不利于纯化。 有机溶剂提取法 是利用黄酮类化合物的性质不同，将桑叶直接用乙醇、甲醇、丙酮、含水 乙醇或含水丙酮提取，提取液浓缩成浸膏，再用上述不同溶剂进行分步处理。 该法是目前国内外使用较广泛的提取方法，该法设备简单，产品得率高，但产 品中杂质含量较高，且有溶剂残留。 常用的溶剂提取方法又可分浸渍法、连续回流提取法、煎煮法等。冷提时 杂质较少，但提取效率低；而热提时则提取效率较高，但杂质较多。较常用的 是连续回流法，如安徽农业大学的张军等口比较了桑叶黄酮的乙醇水、甲醇水 溶液的回流提取工艺，发现在一定范围内，溶剂浓度越大，总黄酮的得率越高。 贵州大学的李先佳等优化了乙醇水溶液提取桑叶总黄酮和多糖的工艺。 （２）超声波提取法 超声提取法指以超声波辐射产生的骚动效应、空化效应和热效应来引起机 械搅拌加速扩散溶解的一种新型提取方法。高中松等比较了醇提法和超声提 取法萃取桑叶总黄酮，发现超声提取效果优于醇提法，超声提取法能更有效的 提高提取效率，对热不稳定成分影响小，且提取时间短，一般为３０ｍｉｎ左右， 但该方法对设备要求较高，成本较高，只适合于小试操作，不适合工业化大规 模生产。 （３）微波提取法 微波萃取又叫微波辅助萃取，是一种非常具有发展潜力的新的萃取技术， 即用微波能加热与样品相接触的溶剂，将所需化合物从样品基体中分离出来并 进入溶剂，是在传统萃取工艺的基础上强化传热、传质的一个过程。该法一般 作为前处理方法与传统有机溶剂萃取相结合使用。李莉发现，桑叶总黄酮用 乙醇水溶液提取，经微波处理后比未经处理的得率高。目前，微波萃取技术已经用于上百种中草药的提取生产线，包括桑叶、葛根、三七、茶叶、银杏等， 但该法的操作成本较高。 （４）超临界流体萃取法 超临界流体萃取法是利用某些溶剂在临界值以上具有的特性来提取混合 物中可溶性组分的一种新的分离技术。与传统的溶剂提取法相比，超临界流体 萃取法具有快速、萃取效率高、产物纯度高、无溶剂残留及天然活性成分不被 破坏等特点。王正云研究了超临界Ｃ０２萃取芦笋总黄酮的工艺，发现其黄酮 得率是和常规溶剂乙醇提取法总黄酮得率的２．７倍。何扩等比较了乙醇浸提法 与超临界Ｃ０２萃取法提取银杏叶黄酮类物质，发现产物的纯度是直接用乙醇提 取的２．４３倍。随着超临界流体的迅速发展，用该技术提取天然植物中的有效成 分也越来越广泛。但是该设备费用比较昂贵，而且需高压技术，在设备和过程 设计上还缺乏基础数据和系统的方法，在我国的应用还未普及。
１．２．１．３黄酮类化合物的纯化方法 黄酮类化合物的纯化方法很多，主要有柱层析法、ＨＰＬＣ法以及近年来才 发展起来的超临界Ｃ０２萃取法和大孔树脂吸附法等。 （１）柱层析法 聚酰胺柱层析法 聚酰胺对各种黄酮类化合物均有较好的分离效果，其层析容量较大，适合 于制备性分离，但洗脱速度慢，死吸附较大。 硅胶柱层析法 硅胶柱层析法的应用范围最广，不但可以分离黄酮苷类，还可以分离各种 黄酮苷元。它可以分离极性较低的黄酮类化合物如异黄酮、黄烷类、二氢黄酮（醇） 和高度甲基化或乙酰化的黄酮和黄酮醇，如用一氯仿溶剂系统从野靛中分 离异黄酮类。硅胶在降活后也可用于极性较大的黄酮类化合物，如甙类、多羟 基黄酮类化合物。如穿心莲根丙酮提取物用苯一已烷（３：１）洗脱得到芹菜素７，４ 一二甲醚，用苯洗脱得到５－ＯＨ．７，８，２．四甲氧基黄酮醇。 但硅胶的价格比较高，且不能重复利用，故工业化成本太高，一般尽量不 采用。 葡萄糖凝胶柱层析法 葡聚糖凝胶是一种淋洗速度快，可以反复使用，没有损失的非常好的分离 和纯化黄酮类化合物的填充材料。葡聚糖凝胶在分离游离黄酮时，主要靠吸附 作用，吸附程度取决于游离酚羟基的数目，游离酚羟基的数目越多越难以洗脱； 在分离黄酮甙时，则分子筛的属性起主导作用，相对分子质量的大小或含糖的 多少决定化合物被洗脱的先后，分子量越大，连的糖越多，越易洗脱。如它主 要靠分子筛作用分离黄酮苷类，在洗脱时，一般分子量的大小顺序洗出柱体。 ＨＰＬＣ法较纸色谱、柱色谱、薄层色谱的分离效果更理想，但考虑到其分离成本较高，一般只用于少量超纯样品的制备，更多的是用于黄酮类化合物的 定性、定量分析。 （３）超临界Ｃ０２萃取法 超临界Ｃ０２萃取法因具有独特优点而倍受青睐，何扩等发现采用有机溶 剂萃取的银杏黄酮存在有机溶剂残留问题，而超临界Ｃ０２能很好地解决该问题， 并能分离纯化初纯度较高的银杏黄酮。 （４）大孔树脂吸附法 这是近１０年来发展起来的一类有机高分子聚合物吸附剂，它具有物化稳定 性高、吸附选择性好、不受无机物存在影响、再生简单、解吸条件温和、使用 周期长、易于构成闭路循环及节省费用等优点，广泛用于物质的分离纯化。如 采用弱极性ＡＢ一８大孔树脂对葛根黄酮、银杏叶黄酮进行吸附分离，提取物中黄 酮含量提高近１倍；吉云秀等曾用Ｄ１０１型吸附树脂成功的纯化了银杏叶中的 黄酮类化合物，效果良好。 综上所述，黄酮化合物有多种纯化方法，但大部分都存在不同程度的缺点 而使之工业化生产受限，而大孔树脂法因其分离效果好、条件温和、便于操作 及经济实用等特点，较其他方法更有市场应用前景。
１．２．２ ＤＮＪ的国内外研究现状 桑叶中的生物碱含量比较低，但其对降血糖的功效非常显著，其中，主要 功效成分为ＤＮＪ，大约占１‰，目前对于生物碱的研究都集中于ＤＮＪ上。 ＤＮＪ的结构式如图ｌ－２所示，它属于型类化合物，其化学名称是３，４， ５．三羟基．２．羟甲基四氢吡啶，分子式为Ｃ６Ｈ１３Ｎ０４。 ｏＨ图１－２ ＤＮＪ结构式 Ｆｉｇ．１—２ ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌｆｏｒｍｕｌａｏｆＤＮＪ 目前对于ＤＮＪ的提取文献报道比较少，主要集中于以下几种： （１）蒸馏水提取法 杨海霞采用蒸馏水提取法，提取了桑叶中的ＤＮＪ，然后利用阳离子交换 柱层析对ＤＮＪ进行了初步纯化，最后用分光光度法测定桑叶中ＤＮＪ的含量，这 是ＤＮＪ提取分离中最初的方法。 （２）去离子水煎煮法 姜永涛等采用去离子水煎煮法提取桑叶中的ＤＮＪ，然后采用７３２（Ｈ型）离子交换树脂对ＤＮＪ进行初步纯化，最后采用ＨＰＬＣ．ＥＬＳＤ法检测其含量。 （３）酸水提取法 欧阳臻等采用０．０５ｍｏｌ／Ｌ盐酸提取桑叶干燥粉末中的ＤＮＪ，在ｐＨ８．５的硼 酸盐缓冲液条件下，用ＦＭＯＣ．Ｃ１与ＤＮＪ反应生成荧光产物，然后用ＲＰ．ＨＰＬＣ法 测定ＤＮＪ的含量。 （４）乙醇超声提取法 李宇亮等研究了从桑叶中提取分离ＤＮＪ，探讨了提取剂、提取方法、料 液比、提取次数、时间等因素对提取率的影响。实验得到了提取的最佳条件是： 以６５％的乙醇为提取剂，按料液比ｌ：８和１：４，超声强化细胞破碎２０ｍｉｎ（功率 １８００Ｗ），７３２Ｈ阳离子树脂分离，Ｏ．２５ｍｏｌ／Ｌ氨水洗脱（速度ｌ～２ｍＬ／ｍｉｎ）。张作 法等１４６１在２００６年测定桑枝中ＤＮＪ含量时，采用的是盐酸超声波提取，ＦＭＯＣ．Ｃ１ 标记，用配有荧光检测器的反相高效液相色谱法检测ＤＮＪ的含量。
１．２．３ 提取物质量标准的国内外研究现状 目前，绝大多数的植物提取物没有国家标准或行业标准，企业多以合同中 的质量条款作为产品交付的依据，产品质量的检测方法较为混乱，给生产经营 带来了障碍，同时给产业的发展提出了挑战。 业内少数企业已初步建立企业技术标准体系，如湖南宏生堂制药有限公司 的“二个标准三个规程”：药材质量标准和提取物质量标准，药材种植规程、 提取物生产工艺规程和检验操作规程。外经贸部已于本年度批准“单味植物提 取物进出口质量标准”课题研究，有望为行业提出一套标准。 美国ＦＤＡ开始接受指纹图谱作为评价植物药质量的手段，在申报ＩＮＤ （ｉｎｖｅｓｉｔｉｇａｔｉｏｎａｌｎｅｗｄｒｕｇ）的ＣＭＣ（Ｃｈｅｍｉｓｔｙ，ｍａｎｕｆａｔｕｒｅ ａｎｄｅｏｎｔｒｏ １）资料时， 植物物质（Ｂｏｔａｎｉｃａｌｄｒｕｇｓｕｂｓｔａｎｃｅ）和植物药产品（Ｂｏｔａｎｉｃａｌｄｒｕｇｐｒｏｄｕｃｔ）的质量 控制可以采用指纹图谱。 此外，英国、印度以及ＷＨＯ等都采用质量标准进行植物药（草药）的质量 评价。国外开展药材标准提取物的工作已经有近２０年，并且形成了一定的市场， 如银杏叶提取物及其制剂形成了年销售几十亿美元的规模。
１．３ 课题的目的及研究意义 １．３．１ 课题的目的及研究内容 目前市场上的桑叶提取物品种数量多，产品规格杂，没有一个通行的质量 标准，这种现象造成桑叶提取物市场比较混乱，给市场的正常运行及发展带来 很大障碍，为了解决这个问题，必须对桑叶提取物的质量标准进行统一规范化， 这就是本课题立题的出发点。 本课题的主要研究内容分为以下四个方面： （１）桑叶提取物的检测方法研究（２）桑叶黄酮和ＤＮＪ的同步高效提取工艺的研究 （３）桑叶总黄酮的纯化工艺的研究 （４）富含酮碱的桑叶提取物质量标准（草案）的拟定 １．３．２课题的意义 本课题的研究可以使原料药市场上的富含酮碱的桑叶提取物有标准可循， 可以改善目前市场中桑叶提取物规格不均的现状，规范了生产厂家的操作，给 购买厂家带来便利，对于中药的质量稳定化及可控化具有积极的促进意义。
ｌＯ 第二章实验材料和方法 ２．１ 实验材料、试剂与主要仪器设备 ２．１．１ 实验材料 桑叶，由合肥大药房提供，于０７年１０月产自安徽毫州，经合肥工业大学 的干燥叶片。 桑叶提取物，自制。 ２．１．２ 实验试剂 使用的主要试剂见表２—１。 表２－１主要试剂 Ｔａｈｉｅ２－１ Ｍａｉｎｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅａｇｅｎｔ ２．１．３ 实验主要仪器设备 使用的主要仪器设备如表２．２。 ２．２黄酮类化合物的检测方法 黄酮类化合物的定量检测方法报道最多的是亚硝酸钠．硝酸铝显色法，但 该法不够准确，近年来，ＨＰＬＣ法逐渐被运用到黄酮类化合物的定量检测中。 桑叶提取物中的黄酮类化合物由黄酮苷类和黄酮苷元类组成，其中，黄酮 苷类占绝大部分，主要有主要是芸香苷、槲皮苷、异槲皮苷和紫云英苷等，前 三者和后者分别是槲皮素和山奈酚的糖苷：另有很少一部分游离的黄酮苷元， 即槲皮素和山奈酚等。由于将桑叶黄酮苷逐个分开进行检测的方法太繁杂且不 可行，故可将样品中的黄酮苷经水解转化为槲皮素和山奈酚，再经ＨＰＬＣ分析。 表２－２主要实验仪器设备 Ｔａｂｌｅ２－２ Ｍａｉｎ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔｓ ２．２．１ 色谱条件 色谱柱：Ｒｅｓｔｅｋ Ｃ１８柱（５ｐｍ，４．６２５０ｒａｍ）：检测器：Ｗａｔｅｒｓ ２４８７紫外检 测器；流动相：甲醇．０．４％磷酸溶液＝５０：ｓｏ（ｒ／功；流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；柱温： ２５；检测波长：３６０ｎｌｎ；进样量：１０肛Ｌ。 ２．２．２混合对照品溶液的制备 精密称取在１１０干燥至恒重的槲皮素对照品７．５０ｍｇ，山奈酚对照品７．５０ ｍｇ，用甲醇超声溶解并定容至２５ ｍＬ。 ２．２．３样品溶液的制备 精确称取桑叶提取物３００ｍｇ于２５０ｍＬ圆底烧瓶中，加入甲醇．２５％盐酸 混合水解液（４：１，刃功适量，使水解液的体积与总黄酮量比例（Ｖｉｍ，单位为Ｌ／ｇ） １２ 为３．００，８０水浴回流水解１ｈ，冷却至室温，１００００ｒ／ｒａｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上 清液，微孔滤膜滤过。 ２．２．４方法学考察 ２．２．４．１ 线性关系的考察 取混合对照品溶液１ｍＬ，用甲醇定容至１０ｍＬ。取１．２５、２．５、５、１０、２０ｍＬ 用甲醇定容至５０ｍＬ，分别迸样１０ ｐＬ，测定，以峰面积ｙ（ｇｖ ｓ）对溶液质量浓度 ｘ（ｍｇ／ｍＬ）进行线性回归。 ２．２．４．２精密度的考察 取一定浓度的槲皮素和山奈酚的混合对照液，连续进样５次，测定槲皮素 ２．２．４．３重现性的考察取桑叶提取物适量，按２．２．３项方法制备５份样品溶液，测定槲皮素和山 奈酚的含量。 ２．２．４．４稳定性的考察 精密称取５份３００ｍｇ桑叶提取物，按２．２．３项方法制备样品溶液，分别在０、 ２、４、８、１６ｈ测定槲皮素和山奈酚的含量。 ２．２．４．５ 加样回收率的考察 精密称取５份３００ｍｇ桑叶提取物，分别加入一定量槲皮素对照品和山奈酚 对照品，按２．２．３项方法制各样品溶液，测定，计算加样回收率。 ２．２．５ 样品的测定 将桑叶样品按２．２．２．３项方法制各样品溶液，按２．２．２．１项色谱条件进样，分 别测得槲皮素和山奈酚峰面积，外标法计算槲皮素和山奈酚的含量。 ２．２．６桑叶原料的测定 精密称取１００ ｍｇ干燥桑叶粉末（过６０目筛），按２．２．５项方法测定槲皮素和 山奈酚的含量。 ２．２．７ 酸水解工艺研究 ２．２．７．１ 单因素实验 （１）水解液体积与总黄酮量比例的影响 精密称取桑叶提取物３００ ｒａｇ（总黄酮含量为３．３３％，以下其他单因素及正 交试验均同）各５份，分别加入甲醇．２５％盐酸混合水解液（４：１，功适量，使水 解液的体积与总黄酮量比例（Ｖｉｍ，单位为Ｌ／ｇ）为１．５０－－－４．５０，８０水浴回流水 解１ｈ。 （２）水解温度的影响 精密称取桑叶提取物３００ ｒａｇ各５份，加入甲醇．２５％盐酸混合水解液（４：１， 功适量，使得水解液的体积与总黄酮量比例为３．ＯＯ，分别在５０”－－９０水浴回 流水解１ｈ。 １３ （３）水解时间的影响 精密称取桑叶提取物３００ｍｇ各５份，加入甲醇．２５％盐酸混合水解液（４：ｌ， ｎ适量，使得水解液的体积与总黄酮量比例为３．００，分别在８０水浴回流水 解０．５～２．５ｈ。 ２．２．７．２ 正交实验 ‘根据单因素实验结果，做水解液体积与总黄酮量比例、水解温度和水解时 间的三因素三水平正交实验，实验安排如表２．３。 ２．２．８ 总黄酮苷和黄酮苷元的对应系数的求解 ２．２．８．１ 桑叶提取物中总黄酮的检测 （１）对照品溶液的制备 精密称取在１１０干燥至恒重的芦丁对照品２０．６ ｍｇ至５０ ｍＬ容量瓶中， 加入６０％乙醇，超声溶解，定容至刻度，备用。 表２－３酸水解实验因素水平表Ｌ９（３３） Ｔａｂｌｅ２－３ ＦａｃｔｏｒｓａｎｄｌｅｖｅｌｓＬ９（３３） （２）供试品溶液的制备 称取桑叶提取物适量至５０ｍＬ容量瓶中，加入６０％乙醇，超声溶解，定容 至刻度，即得。 （３）样品的测定 取供试品溶液２．０ｍＬ入２５ｍＬ比色管中，加６０％乙醇至６．０ｍＬ，加入５％ 亚硝酸钠１．０ｍＬ，摇匀，放置６ｒａｉｎ，加入１０％硝酸铝１．０ｍＬ，摇匀，放置６ｒａｉｎ， 加４％ＮａＯＨ溶液１０．０ｍＬ，加６０％乙醇溶液至刻度，摇匀，放置１５ｍｉｎ，在 ５１０ｎｍ处测吸光度。 （４）方法学考察 标准曲线的绘制 精密吸取芦丁对照溶液０．０、Ｏ．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５ｍＬ，分别 置于２５ｍＬ比色管中，各加６０％乙醇至６．０ｍＬ，按样品测定方法测定其吸光 度，绘制浓度Ｃ（ｍｇ／ｍＬ）与吸光度彳的标准曲线。 重现性实验 取桑叶提取物２００ｍｇ各５份，用６０％乙醇定容于５０ｍＬ容量瓶，分别精 １４ 密量取２．０ｍＬ置２５ｍＬ比色管中，按样品测定方法测定。 稳定性实验取桑叶提取物２００ｒａｇ各５份，用６０％乙醇定容于５０ｍＬ容量瓶，按样品 测定方法分别在５，ｌＯ，１５，２０，３０，４０，５０，６０ｍｉｎ测定吸光度。 精密度实验 取对照品溶液１份，按样品测定方法测５次，计算其精密度。 加样回收率实验 取已测知含量的桑叶提取物各５份，分别加入一定量的芦丁对照品，用６０ ％乙醇定容于５０ｍＬ容量瓶，按样品测定方法测定，计算平均加样回收率。 ２．２．８．２ 总黄酮苷和黄酮苷元对应关系的求解 称取等质量的不同类型的桑叶提取物各２份，备用。 （１）水解前总黄酮苷的检测：将不同类型的桑叶提取物，按２．２．８．１中（３） 法测定其总黄酮苷的含量。 （２）水解后总黄酮苷元的检测：将不同类型的桑叶提取物，按２．２．３法水解， ２．３ＤＮＪ的检测方法１ ＤＮＪ的定量检测目前较多报道为柱前衍生化ＨＰＬＣ检测法，其衍生化试剂均 为ＦＭＯＣ，但该衍生化试剂的水解副产物较多，干扰目标峰的判断。本法采用 的衍生化试剂为６一氨基喹啉基一Ｎ一羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯（ＡＱＣ），该试剂可有 效去除干扰物对检测结果的影响。 由于ＤＮＪ是类化合物，其结构中有一个胺基，可与胺类荧光试剂ＡＱＣ 进行衍生化反应，生成ＤＮＪ衍生物和Ｎ．羟基琥珀酰亚氨（ＮＨＳ）。ＤＮＪ的ＡＱＣ衍生 物具有荧光，可经荧光检测器检测其含量，而ＮＨＳ无荧光。多余的衍生试剂能 在１ｍｉｎ内被水解，生成仅有微弱的荧光发射性的水解产物６．氨基喹啉（ＡＭＱ）。 通过调整流动相的组成比例，可消除ＡＭＱ对检测结果的影响。 ＤｅｒｉｖａｆｉｚｅｄＤＮ．，ＮＩＳ 图２－１ ＤＮＪ衍生化反应式 Ｆｉｇ．２－１ＤｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎｏｆＤＮＪ ｌ本论文中ＤＮＪ的检测数据均借鉴同课题组成员吴方睿的论文数据，特此注明。 １５ ２．３．１ 色谱条件 色谱柱：ＲｅｓｔｅｃｋＣ１８柱（５ｒｔｍ，２５０ｍｒｎｘ４．６ ｒａｍ）；流动相：０．０２ｍｏｌ／Ｌ磷 酸二氢钾缓冲液（ｐＨ５．０）：乙腈；８５：１５；流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ：柱温：２５；荧 光检测的激发波长：２５０ｎｍ，发射波长：３９５ｎｍ；进样量１０此。 ２．３．２ 对照品溶液的制备 精密称取５ｍｇＤＮＪ对照品，置于５ｍＬ容量瓶中，纯水超声溶解，定容至 刻度，配制成１ｍｇ／ｍＬ的对照品溶液，置于冰箱中４避光保存。 ２．３．３ 样品溶液的制备 称取２００ｍｇ桑叶提取物粉末，置于５０ｍＬ容量瓶中，纯水超声溶解，定 容至刻度，１００００ｒ／ｒａｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液。 ２．３．４ 样品的测定 取１０“Ｌ样品于衍生用玻璃小管中，加入８０“ＬＫ３８０３缓冲液（ｐＨ＝８．５），涡 旋混合３０Ｓ，与此同时，加入１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＱＣ衍生化试剂溶液ｌＯｐＬ，室温静 置５ｍｉｎ，微孔滤膜滤过，取１０ｐＬ衍生化后样品在２．２．２．５下测定。 ２．３．５ 桑叶原料的测定 准确称取１００ｍｇ干燥桑叶粉末（过６０目筛）于１０ｍＬ离心管中，加入１０ｍ１ ０．０５ｍｏｌ／ＬＨＣｌ水溶液，超声ｌｍｉｎ，离心１０ ｍｉｎ（１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ），取上清液。