摘要 在人们生活水平逐渐提高的今天，自恶性肿瘤以及心血管疾病后，糖尿病已经成为威胁到人类健康的第三大疾病。但是引起糖尿病的原因以及发病机制到现在还并不是非常清楚，当前临床还没有能够完全根治此病的药物。西药治疗糖尿病作用靶点单一，而 且不良反应较大，我国传统中药对糖尿病的治疗历史悠久，无毒副作用，可长期使用。 alba 桑叶为桑科植物桑MorusL．的干燥叶，自古以来，就有用于“止消渴”，即现代糖尿 病的记载。近年来，其降血糖活性作用受到广泛关注和研究。 本文主要以桑叶为研究对象，对桑叶中总生物碱的提取分离工艺、DNJ的纯化和降 血糖活性进行了系统的研究，研究主要内容如下： l、利用单因素试验研究桑叶中总生物碱的提取工艺，试验结果表明，最佳的提取 纯化以后得到总生物碱的浸膏经分析可知，总碱含量最高时为37．55％。 LH．20、大孔树脂，C18反相等色谱及波谱分析 2、综合运用正相硅胶柱、Sephadex 技术对总生物碱浸膏进行了分离纯化，得到了两种氨基酸和证明了总生物碱浸膏中含有 酸，并对DNJ的生源途经做了初步的假说。 3、采用NBDG荧光法测定桑叶乙醇粗提物、桑叶经过纯化后得到的总生物碱部分 和单体DNJ部分对SGLT-2葡萄糖转运体的活性抑制实验，初步证明桑叶经过分离精制 后得到的总生物碱部分具有较好的降血糖活性。
桑叶中总生物碱提取工艺优化及降血糖活性研究 1绪论 除了印度以外，中国是拥有数量最多的糖尿病患者之一的国家。在中国，据估计 国迅猛发展的主要原因就是：经济的快速发展，城市化进程的迅速和人们生活方式的改 变，都给糖尿病带来了可趁之机。 全球糖尿病分布糖尿病是由于高血糖症引起的一种复杂的新陈代谢疾病，会导致一系列有害的结果 尤其对大血管和微血管系统影响最甚。糖尿病患者一般表示为血糖值水平较高，主要是由于不能产生胰岛素或者对胰岛素产生抵抗。糖尿病分为两种类型，一种是l型糖尿病，属于自体免疫性疾病，可能是由于自体免疫系统破坏产生胰岛素的胰腺13细胞引起的；另一种是2型糖尿病，患者主要特征为胰岛素抵抗，相对胰岛素缺乏和高血糖。 糖尿病已经成为世界上lO大导致死亡疾病之一，各种慢性的、严重的并发症对健康和 生命带来了严重的威胁。同时，也造成巨大的资金和资源浪费，因此，尽快研制出一种 新颖的并且副作用小的治疗方法对于控制糖尿病发展是至关重要的。
糖尿病的2种主要类型 1．1目前治疗药物 随着科学技术的进步，抗糖尿病药物可以划分为以下几类： 1．1．1胰岛素类(insulin) 外源性胰岛素分注射用和口服胰岛素两种，诺和诺德开发出新的注射用长效胰岛素 NN304，这种制剂可以在血浆中与白蛋白结合，阻止了抗体的形成，不会被免疫系作异 物，因此延长了活性，作用稳定。口服型当前研究的剂型有胶囊、胶丸、微囊、凝胶、 片胶及油水复合包裹性乳液。 胰岛素作用药，这类药物主要为胰岛素促分泌剂、胰岛素增敏剂、胰岛素生长因子 ．I(IGH)和C肽等。
1．1．2磺酰脲类(sulfonylureas，su) 磺酰脲类药物目前种类比较多，大多具有相同的母体结构，一般为R1．S04N- HCONH．R2。作用机理主要通过与夕细胞的磺酰受体结合，诱导胰岛素地分泌，从而降桑叶中总生物碱提取工艺优化及降血糖活性研究)。
1．1．3双胍类(biquanides) 双胍类降血糖类药物可以抑制肝糖元异生，减少葡萄糖的来源，增强组织对葡萄糖 的摄取和利用，增强胰岛素的敏感性，抑制胰高血糖素的释放。现在主要使用的有甲福 h。另外还有苯乙福明明(metformin，二甲双胍)，其降低血糖的作用能维持5^6 们的作用机理可能为减少肝脏产生葡萄糖，促进肌肉摄取葡萄糖，增加胰岛素敏感性， 抑制葡萄糖异生；延缓葡萄糖在肠壁的吸收，从而具有降低饭后高血糖的作用。
1．1．4 n．葡萄糖苷酶抑制剂(CIGE) a．葡萄糖苷酶抑制剂是以延缓肠道碳水化合物吸收而达到治疗糖尿病的降血糖药物，它作为新一类降血糖药出现于八十年代，其作用机制为：可以通过竞争性抑制位于 小肠上的各种旺．葡萄糖苷酶，使淀粉类降解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道对葡萄 糖的吸收，达到降低饭后高血糖的作用。西方国家饮食中糖类化合物占他们总能量的 50％左右，日常食物中的糖类化合物基本上都是以二糖和多糖的形式存在。人体内，二 糖和多糖一般必须经过很多种酶的作用，然后分解成单糖后才能被人体所吸收，例如a． 淀粉酶、Gt．葡萄糖苷酶、a．半乳糖酶(乳糖酶)是降解二糖和多糖的一些常见酶，它们分 布在小肠上皮绒毛膜刷状沿上。a．葡萄糖苷酶抑制剂通过竞争性抑制位于小肠上的各种 a．葡萄糖苷酶，达到减少糖类的降解的目的，并且延缓糖类化合物的吸收，从而有效地 降低糖尿病患者饭后血糖浓度的升高，达到治疗高血糖的目的。 目前已经上市并且在临床上应用的a一葡萄糖苷酶抑制剂类降血糖药物主要有拜唐 由Bayer公司研制开发的第一个用于临床的．葡萄糖苷酶抑制剂，此药是由白色放线菌 属菌株发酵而成，仅有微量原形或分解产物被人体所吸收，很大一部分经肠道排出体外。 拜唐平是一个类似四糖结构的物质，该药能可逆地抑制小肠绒毛上的多种a．葡萄糖苷酶，阻止l，4．糖苷键水解，延缓蔗糖向葡萄糖、果糖的转化。倍欣即伏格列波糖是由日 本武田药品有限公司生产，并于1994年在日本上市，通过抑制a．葡萄糖苷酶，在碳 水化合物水解的最后一步，延缓双糖(淀粉在淀粉酶作用下水解为双糖)在a．葡萄 糖苷酶作用下水解为单糖，延缓葡萄糖与果糖的吸收速度，从而降低餐后血糖。 该药作用机理虽然与拜唐平相同，但是抑制作用更强，用药剂量更小，且没有a．淀粉酶 3 1绪论的抑制作用。所以在肠道内不会出现淀粉的大分子化合物分解产物存在，不会引起葡萄 糖的吸收障碍，胃肠道的副作用也同样显著减少，另外，此药在体内不会被人体代谢， 口服后立刻随尿液排出人体外。米格列醇是由德国Bayer公司开发生产，与1998年上 市，它是DNJ的一种衍生物，其结构为N．羟乙基-DNJ，特点为口服效果良好，小剂量 吸收充分，对a．葡萄糖苷酶抑制作用强烈。
1．2桑叶的化学成分 alba leaves)，别名铁扇子，为桑科植物桑树(MorusL．)的叶子， 桑叶(mulberry 是国家卫生部发布的药食两用的植物叶，其味甘、苦；性寒；归肺，肝经，具有疏散风 热、平抑肝阳、清肺润燥、止血凉血等作用。此属植物世界上大约有16种，分别 分布于北温带、亚洲热带、非洲热带和美洲地区。中国的桑树资源以丰富著称，其每 年的桑叶的产量位居世界前列，桑叶分布在全国各地，其中中国南部的桑叶产量较大， 主要用于养蚕，江苏和浙江区域产量最大。由于中国气候条件复杂，生态环境多样， 造就了非常丰富的桑树种类资源；目前中国有15个桑种，主要有：家桑(Morusatba)、 australis 鸡桑(Morus Poir)、华桑(MorusCathayanaHemsl)、蒙桑(MorusMongolica diabolia)、长果桑(MorusWall)。当代药理研究证明，桑 Schneid)、山桑(Morus laevigata 叶具有很高的营养价值，并且还含有人类所必需的一些氨基酸，此外还包含维生素、无 表1桑叶介绍 。
1．2．1桑叶的主要活性成分研究现状 最近几年，世界各国学者针对桑叶这个物种进行了很多的研究。经过大量研究发现 桑叶是一种具有非常高的营养价值的物种，其中包括多种具有生理活性的物质：不饱和桑叶中总生物碱提取工艺优化及降血糖活性研究 脂肪酸5种、饱和脂肪酸13种；可溶性碳水化合物达到259／lOOg干桑叶；蛋白质含量 含有大量的维生素和有机酸。
1．2．2氨基酸 acid)等多种 acid)、哌可啉酸(pipecolicacid)、5一羟基哌可啉酸(5-hydroxypipecolic 元的活性，预防神经细胞过热，从而可以从源头上镇静神经，达到抗焦虑的效果。
1．2．3黄酮及其衍生物类化合物 黄酮类化合物是一种存在于自然界的、具有2．苯基色原酮(flavone)结构的化合物， 并且是一种强抗氧化剂，能清除人体内的一些氧自由基。黄酮类化合物在植物体内的形 成，是由葡萄糖分布经过莽草酸途径和乙酸．丙二酸途径生成羟基桂皮酸和三个分子的 乙酸，然后合成查尔酮，再衍变为各类黄酮类化合物。世界各国研究人员从桑属植物中 分离纯化得到一系列黄酮及其衍生物，其中主要有黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇等。日 本学者Kayo 皮苷、芸香苷、槲皮素等。 O O 黄酮 H H O 二氢黄酮醇 槲皮素 的类生物碱，拥有非常强的a．葡萄糖苷酶的抑制活性和非常低的细胞毒性，体内试验证明它拥有明显的降血糖作用；这种类生物碱是一类具有氮元素并且在成环 结构上拥有多个羟基的化合物，其结构与单糖类似。正是因为它的结构特殊，并且与单 糖结构相似，从而他们在人体内很有可能将糖的位置取而代之而与a．葡萄糖苷酶相结 合，并且由于氮元素的存在可能会导致这种结合变得更强，因此达到了竞争性地抑制了 a一葡萄糖苷酶活性的作用，从而进一步影响到了糖类化合物的代谢。桑叶中总生物碱提取工艺优化及降血糖活性研究。
1．3桑叶的药理作用研究 1．3．1降血糖，降血脂 桑叶拥有非常好的降低血糖的功效。它含有的蜕皮甾酮对由于四氧嘧啶引起的大鼠 糖尿病，导致血糖的升高具有很好的降低血糖的作用，可促进葡萄糖转化为糖元，但不 改变正常动物体内的血糖水平。另外桑叶能有效的降低糖尿病患者血糖的浓度，总胆固 (DNJ)类化合物起到抑制a．葡萄糖苷酶的作用。1．脱氧野尻霉素类物质能和小肠中的 麦芽糖酶、蔗糖酶和乳糖酶等a．葡萄糖苷酶进行结合，导致二糖不能水解为单糖而被吸 收，从而可以达到显著地抑制了饭后血糖浓度急剧上升的情况。 Lee等人在文献中报道了通过给肥胖小鼠喂食桑叶、香蜂草和茵陈蒿这三种草本植 物的混合物，发现可以明显改善小鼠的脂质代谢、控制身体重量和减少脂肪的摄入，暗示了桑叶、香蜂草和茵陈蒿可以调节高血脂症状12 通过摄入含有0．24％的一脱氧野尻霉素桑叶提取物的稀释溶液，并用改良的达尔奎斯特 方法进行研究观察，发现4种人类样品的蔗糖酶活性被抑制了96％、麦芽糖酶和异麦芽 糖酶分别被抑制了95％和99％，海藻糖酶和乳糖酶被抑制了44％和38％。这些数据充 分表明了桑叶的提取物可作为一种保健食品来开发，并有助于预防糖尿病lZ引。 As趾等研究人员对从桑叶中提取纯化得到7种生物碱做了降血糖活性试验的比较，发现了含有多羟基的去甲莨菪碱显示出非常强的a．葡萄糖苷酶抑制活性。Kimllra M．等研究人员对上面发现的7种生物碱做了由STZ导致的患有糖尿病小鼠的降血糖 GAL．DNJ这种生物碱。 日本的宫原等研究人员选用了自然发病症状相似的成人型糖尿病和糖尿病合并 症大鼠(WBN／KOB雄性大鼠)进行了详细的分组实验研究，实验数据的结果发现雄性大 鼠在第46周龄时，其空腹血糖值为18．72mmol／L，表现出显著的糖尿病症状；当给这只 雄性大鼠喂食含有2．5％桑叶粉的饲料时，测量得到其空腹血糖值为8．53mmol／L；当喂 食含有5．0％桑叶粉的饲料时，测量得到其空腹血糖值为6．33mmol／L。后面的两组大鼠 实验表明血糖水平的降低均是由于桑叶中含有的DNJ阻止了a．葡萄糖苷酶的活性，使 二糖不能水解为单糖被大鼠吸收，从而抑制了饭后血糖水平的升高。其耐糖量试验(GTT) 也证明了桑叶可以抑制胰腺兰格尔罕氏岛的病变发展，同时又可以维持胰岛素的正常分 泌，从而抑制了血糖水平的升高，减缓了糖尿病的产生和恶化。陈福君等研究人员对从桑叶中分离纯化得到的桑叶总多糖(TPM)，进行了腹腔注 射给药对由四氧嘧啶引起的糖尿病小鼠做了血糖活性实验，发现其具有显著的降血糖活 性；另外，他们还发现了桑叶总多糖能够提高糖尿病小鼠的耐糖能力，增加肝糖元的含 量从而降低肝葡萄糖；而且桑叶总多糖腹腔注射给药能够提高正常大鼠血液中的胰岛素 的含量。
1．3．2降血压作用 桑叶中的丫．氨基丁酸可以用于降低血压水平。研究人员做了相关的动物实验，往患 有高血压症状的老鼠的饲料中添加桑叶，经过连续数天的喂食，观察发现息有高血压病 的老鼠其复发次数明显减少，这与桑叶中含有的丫-氨基丁酸(GABA)起作用有一定的关 系，丫．氨基丁酸可以作用于血管的运动中枢，有效地促进血管的舒张，从而达到降血压 的作用。
1．3．3抗衰老作用 桑叶拥有类似人参的抗衰老、稳定神经系统功能和补益的功效，可以缓解由生理变 化导致的情绪波动，并且桑叶中SOD含量丰富，多酚类化合物，黄酮类化合物，都能 够通过清除自由基来预防氧化损伤，从而可以达到抗衰老的效果。
1．3．4抗癌、抗肿瘤、抗病毒作用 桑叶中含有的功能性成分非常丰富，如SOD、GABA、DNJ、类黄酮、桑素都可以 抑制基因和染色体的变异，达到防止癌症的效果。Kiln等【371从桑叶里面提取纯化得到了 两种类黄酮，分别是合槲皮素．3，7．二氧．B．D．吡喃葡萄糖苷和槲皮素．3．13．D．吡喃葡萄糖 苷，他们对人体内动粒白血病细胞系的生长有抑制作用，前者还诱导丁白血病细胞系的 分化。桑叶内SOD拥有抗癌作用。桑叶内桑素也拥有抗癌作用。
1．3．5抗炎，抑菌 中国的本草纲目记录了桑叶拥有清热解毒的功效，当代药理研究证明桑叶还具有比 较强的抗炎作用，与祛风、清热功效相符。
1．3．6解痉，抗溃疡 桑叶内含有的槲皮素可以减小支气管和肠平滑肌的张力，它的解痉效果胜于芸香 苷，可以降低大鼠的运动功能，且可以解除由于氯化钡而导致的小肠平滑肌的痉挛，皮 下进行注射芸香苷5-lOmg／kg可以大大减少大鼠由于结扎幽门导致的胃溃疡的病灶数目。
1．3．7改善肠道功能桑叶中总生物碱提取工艺优化及降血糖活性研究 桑叶里面含有一些特殊的成分可以抑制乳糖、蔗糖和麦芽糖水解，甾小肠中没有被 吸收的糖类被转入到大肠，因为大肠内的菌体的作用，使其发酵产生H2和C02，并且 产生了醋酸、乳酸、丙酸和丁酸等有机酸，这些有机酸可以使肠内的环境转变成酸性， 从而抑制了有害细菌的繁殖，来缓解放屁、腹胀、肠鸣等症状。 1．3．8其他作用 桑叶里的矿物质含量丰富，并且容易被人体所吸收，对补铁、补钙、补锌和补镁都 拥有特殊的功效。另外桑叶里面还含有多种维生素，特别对于抑制变应原效应，抑制体 内过氧化物生成的作用，抑制蛊栓形成，从而可以被用于美容护肤，减肥和白发转黑。
1．4卜脱氧野尻霉素类化合物研究进展 1．4．1化学结构 分子式为：C6H13N04。分子量为163．173。 H：潇 H—HOH2C-H 图4DNJ的化学结构 的类生物碱及其衍生物，他们具有抗病毒、降血糖、抗肿瘤转移等作用。目前已经 式如下图【391： 9 植物中，桑属植物中的DNJ含量最高。 Sub Hang 125％。风信子是一种百合科植物，Asano等研究人员从风信子鳞茎 450mg，含量0．01 桑叶中总生物碱提取工艺优化及降血糖活性研究 的甲醇粗提物中分离纯化得到了DNJ，7．6kg的新鲜风信子鳞茎可以分离得到大约 160mgDNJ，含量为0．001 triphylla 为0．00086％。此外，爵床科植物(Jacobniaisuberecta)的叶中也含有DNJ。 微生物中的DNJ Ezuret471等研究人员首先从 浅紫灰链霉菌的一些菌株的发酵液可以得到DNJ。Yohji 土壤中分离得到了DNJ的链霉菌，经过鉴定发现它是浅紫灰链霉菌SEN．158。研究人 员从土壤中新分离得到的8500株链霉菌中，成功地筛选出96株包含DNJ的菌株。从 土壤中得到的浅紫灰链霉菌MB．733的变异菌株浅紫灰链霉菌GC．148在发酵罐内进行 发酵，从其培养得到的过滤液里面能够分离得到DNJ。浅紫灰链霉菌GC．148的培养过 如果在培养过程中改进、优化培养基，并且正确选用诱变剂，DNJ的含量能够增加到 27．33倍。
1．4．3 DNJ的药理作用 作为一种单糖的类似物，DNJ环上的氮原子取代了原先的氧原子，这种结构上的相 似性使得DNJ能够模拟许多糖类水解过程中发生的酶催化反应，显示出潜在的抑制a． 葡萄糖苷酶的活性。a．葡萄糖苷酶能够参与很多生物过程，例如糖聚合体的溶酶体代谢和糖蛋白翻译后的处理等。DNJ作为一种n．葡萄糖苷酶抑制剂己显示出具有潜在的降血 糖、抗病毒、抗炎等药理活性。 降血糖作用 对于所有哺乳动物来说，DNJ是一种a．葡萄糖苷酶的有效抑制剂，他可以通过减少 糖类化合物的消化和葡萄糖的吸收来达到降低饭后高血糖的水平。正是因为这一特性， DNJ将很有可能被用于治疗糖尿病及其糖尿病的一些并发症和相关的机能紊。然 而，尽管DNJ在体外实验表现出极好的a．葡萄糖苷酶的抑制活性，但它在用于体内实 验时的效果却一般。因此，人们想通过合成的方法制备大量的DNJ衍生物，希望可 MDL 25637和MDL73945的DNJ衍生物被用来作为仅．葡萄糖苷酶更有效的抑制剂(图 5)。有报道称在动物试验中它们可以有效地降低饭后血糖和胰岛素水平【5卜541，而米格 表现出很强的0【．葡萄糖苷酶抑制活性。 H。繇HOH2COHcH2cH2。HH。 米格列醇(miglit01) OCH3 MDL73945 H翟∑恋HO—J·7 CH2CH2--O C00C2H5 r’吣 格列酯(emiglitate) HO．弋o--溜-一＼-21 un篡迭Q．f叱 №H10J潍夕 oH MDL25637 图6米格列醇，乙格列酯，MDL25637，MDL73945 抗病毒作用 人类免疫缺陷病毒(HIV)是一种逆转录酶病毒，DNJ具有明显的抗逆转录酶病毒活 性，并且伴随着DNJ剂量的增加，其抑制能力越强。糖蛋白在体内形成的过程中多糖 前体转移到新生肽和后面的葡萄糖修饰等糖基化的步骤对HIV被膜的加工和折叠是必 要的。通过a一葡萄糖苷酶I和II切断外接a．1，2葡萄糖残基和内接a．1，3葡萄糖残基可 以对葡萄糖进行修饰，由于1．脱氧野尻霉素是这些酶的抑制剂，进而可以抑制葡萄糖的 修饰，从而改变人类免疫缺陷病毒在CD4+培养细胞中的感染力。此外，因为1．脱氧野 尻霉素对葡萄糖苷酶I的抑制作用而引起未成熟糖蛋白的积累，很有可能通过抑制细胞 的融合与寄主细胞受体的结合，并且减弱病毒的穿透力，协同来抑制MoLV的复制，从 而达到抑制病毒活性的作用。 抑制肿瘤转移的作用 Tsutomu 关的一些衍生物及其类似物的抗肿瘤转移活性，数据结果表明DNJ对肿瘤转移的抑制 率达到了80．5％，且进一步阐述抗肿瘤的转移活性与抗葡萄糖苷酶和抗B．葡萄糖苷酸 桑叶中总生物碱提取工艺优化及降血糖活性研究 酶活性的联系。
1．4．4DNJ的检测和分析 1．脱氧野尻霉素类化合物具有仅．1，4．葡萄糖类似结构，分子中不含生色基团而且紫 外吸收低，因此，难于直接进行可见．紫外光检测和荧光检测。当前，1．脱氧野尻霉素多 羟基类化合物的测量方法主要采取硅烷化衍生气相色谱．质谱法唧j、柱前荧光衍生- 化衍生产物会对气相色谱柱造成一定污染，现已较少使用；柱前荧光衍生化高效液相色 谱法存在操作繁琐、衍生化反应需严格控制pH值以及衍生试剂干扰测定等缺点，现在 也很少使用，目前应用较多的是高效液相色谱．蒸发光散射检测法，它具有快速、测量 准确、操作方便等特点。
1．4．5 DNJ的分离和纯化 由于DNJ定量分析困难且在植物中含量极微等原因，关于桑叶中DNJ的分离和纯 化相关文献报道较少。苏海涯等研究人员发现自然风干的桑叶应用热水可分离纯化桑叶 中的1．脱氧野尻霉素，经过含量测定，1．脱氧野尻霉素在干桑叶中的含量大约是 100．200mg／kg[671。 Naoki Asano，Tom Yasuda等研究人员采取反复利用离子交换层 Yamashita,Kayo 析的方法，从桑树和蚕宝宝中分离得到了18种多羟基生物碱，但此方法非常耗费时间， 并且操作繁琐，不利于工艺化，一般只能用于实验室操作。 李宇亮、李剑敏、吴雅睿等研究人员用65％乙醇溶液作为提取溶剂，料液比是1：8， 应用超声强化细胞破碎。其提取率达到了95．8％。此分离工艺提取率比较高，但使用超 声波强化DNJ溶出不适用于工业化生产。 1．4．6 DNJ降血糖活性检测 根据大量文献报道，目前主流测定桑叶不同组分的降血糖作用方法：采用四氧 嘧啶诱导的糖尿病小鼠模型，观察桑叶中生物碱组分对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠血糖 及肝糖原影响。 具体步骤如下： ①糖尿病动物模型的建立，采取腹腔注射的方法对小鼠进行糖尿病造模，按 200mg／kg对小鼠腹腔注射四氧嘧啶，造模3d后取尾血测血糖，选择血糖值高于 14．9mmol／L的小鼠进行实验，实验动物按血糖随机分组。 ②根据从桑叶中所分离得到的纯组分的数量确定小鼠的组数，其中一组为模型对 照组，其余为给药组。给药组分别按100mg／kg腹腔注射相应的提纯组分，模型对照组 腹腔注射等量生理盐水。连续给药7d，与第8d测定血糖值。本文研究内容 (1)对于目前DNJ提取方法大多操作复杂、费用昂贵，且得率不高，纯度也很难控制， 探索一种新的DNJ分离纯化流程，为工艺化生产和市场需求打下基础。 这样就给检测带来了困难，根据目前众多显色方法，选择一种便于操作和观察的方 法。 (3)建立一种易于普及、操作简便的桑叶总生物碱的含量测定方法。 (4)对得到的总生物碱浸膏进行分离纯化和结构鉴定。 (5)对桑叶经过分离工艺得到的不同组分进行降血糖活性研究。
桑叶中总生物碱提取工艺优化及降血糖活性研究 2桑叶中总生物碱提取工艺研究 目前桑叶中水溶性生物碱主要采用乙醇回流法，但工艺大多比较复杂冗长，为了能 更好地适应需求，通过不断地尝试不同的工艺流程和采用不同型号的柱层析材料，最终 将工艺缩减为3个部分，分别为乙醇粗提部分、离子交换树脂层析部分和正丁醇萃取部 分。
2．1材料和仪器 2．1．1实验材料 桑叶 江苏省南京市 盐酸 上海中试化工总公司 氨水 上海中试化工总公司 甲醇、乙醇(工业纯) 全部经旋蒸后使用 正丁醇 上海申博化工有限公司 DNJ标准品 ． 天津马克生物技术有限公司 X 001l、001×07、001×14．5阳离子交天津兴南允能高分子技术有限公司 换树脂 717阴离子交换树脂 南京宁试化学试剂有限公司 ODS反相硅胶 进口GHODSAl2S50 青岛海洋化工厂分厂 柱层析硅胶(100．200目，200．300目) 硅胶G板 LH-20 GEHealthcare Sephadex 2．1．2实验仪器 分析天平 岛津AUYl20 紫外灯：ZF．2型 上海市安亭电子仪器厂 N．1001 旋转蒸发仪EYELA 上海爱朗仪器有限公司 SHB．III循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司 DHG．9053A电热鼓风干燥箱 上海恒科技有限公司 MS Thermo LC／MS TSQQuantum 1H-NMR、13C-NMR BrukerDRX．300核磁共振仪
2．2方法与结果 2．2．1薄层显色法(TLC) 由于本工艺分离的是不含有不饱和键的类生物碱，采用常规的显色方法显色比 较困难(如碘化铋钾、茚三酮、碘一碘化钾等试剂)。国外有文献报道‘731采用显色剂为氯桑叶中总生物碱提取工艺优化及降血糖活性研究 2．2．4工艺流程 (1)制备桑叶粉末 将新鲜桑叶除去杂质，置于阴凉处风干，干燥后粉碎、过筛、称重，得到桑叶粉末。 (2)回流提取 65％乙醇，回流提取2小时，过滤，滤渣加入 准确称取2009桑叶粉末，加入1．8L 1．8L65％乙醇，回流提取2小时，过滤，合并滤液。 除滤渣。将所得到滤液加入到已处理好的717阴离子交换树脂中，搅拌30min，浸 泡6h后，直接装柱，将流出液再加入到原阴离子交换树脂中，重复3次，最后加入 300mL水洗脱，收集流出液，浓缩至100mL。 液，减压浓缩至50mL。 丁醇相，减压浓缩至干，即得到桑叶中的总生物碱。 提取分离流程见下图： 2桑叶中总生物碱提取工艺研究1．8L) 图7总生物碱提取工艺流程图 2．2．5不同工艺的比较桑叶中总生物碱提取工艺优化及降血糖活性研究 本试验采用了3种不同型号的阳离子交换树脂进行比较，总共进行了6组工艺流程 的试验，每次称取桑叶粉末2009，其他条件一样，最终得到最优的提取流程工艺。 测量数据如下： 组数 正丁醇相(mg) 盐酸反应量(mL) 总生物碱含量 1 8．2mg 0．60mL 25．41％ 2 9．7mg 0．65mL 24．12％ 3 9．1mg 0．65mL 25．71％ 由上表3组数据可得， 总生物碱含量平均值=25．08％ 总生物碱得率=31．99％ 2009桑叶粉末经过工艺2流程，最终得到正丁醇相1．5299。得到三组总生物碱含量的测 量数据如下： 组数 正丁醇相(m91 盐酸反应量(mL) 总生物碱含量 1 8．2mg 0．50mL 21．95％ 2 6．6rag 0．45mL 24．54％ 3 8．3mg 0．50raL 21．69％ 由上表3组数据可得， 总生物碱含量平均值=22．73％ 总生物碱得率=57．94％ · 测量数据如下： 组数 正丁醇相(mg) 盐酸反应量(mL) 总生物碱含量 1 0．60mL 24．83％ 8．7mg 2 9．5mg 0．68mL 25．76％ 3 8．0mg 0．55mL 24．75％ 由上表3组数据可得， 总生物碱含量平均值=25．11％ 总生物碱得率=23．60％ 19 2桑叶中总生物碱提取工艺研究 桑叶乙醇回流L一717阴离子交H1L一正丁醇相 ● 工艺4： 提取 l I 换树脂 l I离子交换树I l 2009桑叶粉末经过工艺4流程，最终得到正丁醇相626．1mg。得到三组总生物碱含量的 测量数据如下： 组数 正丁醇相(mg) 盐酸反应量(mLl 总生物碱含量 1 11．4mg 1．20mL 37．89％ 2 0．88mL 37．27％ 8．5mg 3 9．6mg 1．OmL 37．50％ 由上表3组数据可得， 总生物碱含量平均值=37．55％ 总生物碱得率=39．18％ ● 717阴离子交 001×07阳 正丁醇相 ——■ ———+ 工艺5： 桑叶提取回流l 换树脂 离子交换树 2009桑叶粉末经过工艺5流程，最终得到正丁醇相650．4mg。得到三组总生物碱含量的 测量数据如下： 组数 正丁醇相(mg) 盐酸反应量(mL) 总生物碱含量 l 8．7mg 0．90mL 37．O％ 2 0．98mL 36．O％ 10．3mg 3 8．1mg 0．82mL 36．4％ 由上表3组数据可得， 总生物碱含量平均值=36．47％ 总生物碱得率一39．30％ 桑叶乙醇回流 717阴离子交 00l×14．5阳 正丁醇相 ●工艺6： 提取 换树脂 离子交换树 2009桑叶粉末经过工艺6流程，最终得到正丁醇相432．5mg。得到三组总生物碱含量的 测量数据如下： 组数 正丁醇相(mg) 盐酸反应量(mL) 总生物碱含量 l 11．3mg 1．14mL 36．32％ 2 1．08mL 37．03％ 10．5mg 3 10．9mg 1．10mL 36．33％ 由上表3组数据可得， 总生物碱含量平均值=36．56％ 总生物碱得率=26．35％ 20 桑叶中总生物碱提取工艺优化及降血糖活性研究 2．2．6工艺结果讨论 根据前面得到的6组工艺流程数据，列表如下： 工艺 总生物碱含量平均值 总生物碱得率 1 25．08％ 31．99％ 2 22．73％ 57．94％ 3 25．11％ 23．60％ 4 37．55％ 39．18％ 5 36．47％ 39．30％ 6 36．56％ 26．35％ 从表中数据观察可以发现，工艺1--．3流程仅采用不同型号的阳离子交换树脂，分别 值基本都在25％左右，相差不大，但是总生物碱得率最大的是工艺2，即采用型号为001 ×07阳离子交换树脂的工艺流程。 工艺4“流程与工艺1~3所不同的是增加了阴离子交换树脂纯化的步骤，明显看出 总生物碱含量平均值有大幅度的提高，基本在36％左右，而工艺4和工艺5的得率明显 比工艺6要高，结合三种型号阳离子交换树脂的经济型，最便宜的是001×07型号的阳 X 离子交换树脂，可以得出最优型号的阳离子交换树脂应该选择00107型号的阳离子交 换树脂。 综上，根据不同数值的比较，不论从经济性，还是从总生物碱含量平均值上，都可 以推出最佳的工艺为5号工艺。 21 3DNJ的纯化3DNJ的纯化 通过乙醇回流得到的粗提液是生物碱混合物，含有色素、蛋白质、氨基酸等物质， 它们的化学组成、聚合度、溶解性能不均一。通过对混合物进行分离纯化，从而得到在 一定分子量分布范围内的生物碱。 综合目标物质DNJ的各种物理化学性质，本实验采用阴、阳离子交换树脂层析技 术对桑叶的乙醇粗提液进行分离纯化。离子交换层析(Ion Exchange 是以离子交换树脂作为固定相，根据流动相中的组分离子与离子交换树脂上的平衡离子 进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中，介 质是由带有电荷的树脂组成。根据上一章节所得出的结论，本实验选用001×07型阳离 子交换树脂作为离子交换层析的分离介质。
3．1离子交换层析的实验应用 离子交换层析是将离子交换树脂作为固定相，液体作为流动相的系统中进行的。 离子交换树脂与水相中的离子或者离子化合物的反应以离子交换的方式进行的，或借助 树脂上电荷基团对溶液中的离子或离子化合物的吸附进行的。这些过程都是可逆的。以 R-S03H表示阳离子交换树脂，他在溶液中解离出的阳离子H+和溶液中阳离子B+可以发 生可逆的交换反应。 R-S03H+B+§R-S03B+I-I* DNJ在酸性溶液下是带正电荷的，能够与阳离子交换树脂发生交换反应，利用这个 原理，从而可以运用离子交换法对DNJ进行分离纯化。当溶液中的DNJ被交换到阳离 子交换树脂上时，先用去离子水冲洗，直到流出液无颜色为止，再选用O．5mol／L的氨水 进行洗脱，收集pH：9～12段的流出液即可。
3．2凝胶树脂层析的实验应用 LH．20是由葡聚糖G．25羟丙基化加工而成，同时具备亲水 本实验采用的Scphadex 和亲脂的双重性质，属于分子筛凝胶，尤其适用于天然产物在有机溶剂中的纯化。 LH．20凝胶以过滤作用为主，兼具反相分配的作用(在反相溶剂中)。因为凝胶 Sephadex 过滤作用，大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。 LH．20对化合物起反相分配的作用，极性大的化合物保 使用反相溶剂洗脱时，Sephadcx 留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。使用正相溶剂洗脱，这主要依 靠凝胶过滤作用来分离。 LH．20柱以后，选用甲醇．水系统洗脱，采用梯度 当桑叶中的总生物碱上Sephadex 洗脱，柱规格2x60cm，装柱体积约120mL。桑叶中总生物碱提取工艺优化及降血糖活性研究 3．3反相硅胶层析的实验应用 本实验采用的是十八烷基键合相硅胶，C18填料，完全球型、表面光滑的多孔硅胶， 具有非常高的表面键合覆盖率，适用于大极性的化合物，一般洗脱系统为水．甲醇。 当样品上到C18柱以后，选用水．甲醇系统进行洗脱，一般比例为7：3，柱规格 2x60cm，装柱体积约120mL。 3．4桑叶的分离纯化 称取干燥的桑叶约5公斤，将其粉碎，用65％乙醇回流提取2次，回流时间为2h， 进行717阴离子交换树脂层析，用去离子水洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至lL，再过 丁醇相。 将干燥的正丁醇相用最少体积的水溶解后，湿法上已经平衡好的正相硅胶柱，采用 甲醇．乙酸乙酯．水系统(2：8：0．5)进行洗脱，收集流出液，TLC薄层层析示踪，合并相 同组分，浓缩至干。