摘要：研究了不同碳源、氮源、碳氮比、培养基及不同pH、温度等条件对野生桑黄——火木层孔菌（Phellinus igniarius）生长发育的影响。结果表明，桑黄菌丝生长的最佳碳源为果糖，最适有机氮源为牛肉膏，最适无机氮源为NH4NO3，最适碳氮比为20∶1；桑黄菌丝生长对pH的适应范围较广，pH 4～9菌丝均可生长，桑黄菌丝适宜在中性偏酸环境下生长；桑黄菌丝最适生长温度为22～28 ℃，并初步探讨桑黄子实体最适生长温度为20 ℃；桑黄最适宜的培养基为新鲜桑枝120 g、麸皮50 g、葡萄糖10 g、琼脂10 g，去离子水定容至500 mL。
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关键词：桑黄（Phellinus igniarius）；生长条件；生长发育
桑黄又名火木层孔菌（Phellinus igniarius），是珍稀药用真菌，其子实体可入药，主要分布在吉林、河北、山西、甘肃、黑龙江等。桑黄在生物抗癌领域被公认为最具抗癌功效的真菌，是国际医药界与保健品行业抗癌产品的生产原料，此外还有抗突变、抗肝纤维化、抗脂质过氧化、降血脂及抗肺炎等作用。
长期大量的开发将导致桑黄资源的枯竭，因此，人工栽培桑黄已成为研究热点。桑黄菌丝体的人工培养已取得初步成功，但有关桑黄的人工栽培驯化还有待研究。为此，通过不同条件对野生桑黄生长发育影响的研究，旨在为桑黄人工栽培驯化提供一定的依据。
1 材料与方法
1.1 材料
2007年6月于江西省九江市郊野外采集新鲜的桑黄，经形态特征和孢子形态的观察，鉴定为火木层孔菌（Phellinus igniarius）。分离纯化获得母种，保存备用。
1.2 试验设计
1）不同碳源试验。基础培养基：马铃薯200～250 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，琼脂20 g，去离子水定容至1 000 mL。以基础培养基20 g葡萄糖的含碳量为准，分别用果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、红糖、可溶性淀粉代替基础培养基中的葡萄糖，基础培养基中其他配方不变。
2）不同氮源试验。以基础培养基1 g蛋白胨的含氮量为准，分别用NH4NO3、KNO3、（NH4）2SO4、NaNO3、酵母膏、牛肉膏代替基础培养基中的蛋白胨，基础培养基中其他配方不变。
3）不同C/N试验。在基础培养基中添加不同重量的蛋白胨（蛋白胨含碳量忽略不计）配成碳氮比为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1的培养基。
4）不同pH试验。调节基础培养基pH分别为4、5、6、7、8、9培养，观察记录。
5）不同温度试验。设置不同温度（5、10、15、18、20、22、25、28、30、32、35、38、40、45 ℃）培养，观察记录。
6）不同培养基配方试验。培养基①：PDA培养基；培养基②：胡萝卜120 g、葡萄糖10 g、琼脂10 g、去离子水定容至500 mL；培养基③：新鲜桑枝120 g、麸皮50 g、葡萄糖10 g、琼脂10 g，去离子水定容至500 mL。将新鲜桑树枝条洗净，切成约5 mm长的短枝与麸皮煮沸1 h，4层纱布过滤；培养基④：玉米粉10 g、蛋白胨0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4 0.2 g、VB1微量，葡萄糖10 g、琼脂10 g，去离子水定容至500 mL；培养基⑤、⑥、⑦、⑧分别用麸皮10 g、豆粉10 g、红糖10 g、蔗糖10 g代替培养基④中的玉米粉，其他配方与培养基④相同。
以上试验组按照常规方法灭菌，接种活化菌丝后置于25 ℃培养箱中培养（温度试验组除外），每天观察1次，共观察记录5 d。每个处理10次重复。
1.3 桑黄菌丝生长观察记录
观察桑黄菌丝的生长状况、菌落特征、菌丝密度等特征，用“十”字交叉法测量菌落直径，用游标卡尺测量每天的生长情况，每隔24 h测量一次，连续测量9 d，取其平均值。
1.4 数据分析
试验数据用SPSS 13.0和Microsoft Excel 2003软件进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 碳源对桑黄菌丝生长的影响
碳素是真菌最重要的营养，它不仅是碳水化合物和蛋白质的基本组成元素，同时又是重要的能量来源。试验结果表明，桑黄菌丝对不同碳源的选择性比较敏感，从图1可知，桑黄菌丝对单糖的利用以果糖最好，菌丝长势好、色白、菌丝致密，对葡萄糖利用次之。对红糖也能很好地利用，这可能是红糖的化学成分较复杂所致，对蔗糖和乳糖利用较差，对麦芽糖利用萌发快，但长势一般，且菌丝生长稀疏。对可溶性淀粉、玉米粉利用一般，对甘露醇的利用最差。由此可见，桑黄菌丝对9种碳源利用效果从好到差为果糖、红糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、葡萄糖、玉米粉、甘露醇。因此，桑黄菌丝生长的最佳碳源为果糖。
2.2 氮源对桑黄菌丝生长的影响
氮素是真菌合成蛋白质、核酸的必需原料，对菌丝的生长发育至关重要[5]。选择7种氮源进行比较，结果表明，桑黄菌丝在供试的7种氮源培养基中生长差异较大。桑黄菌丝在3种有机氮源培养基中以在牛肉膏培养基中长势较好，其次为蛋白胨，酵母膏较差；在4种无机氮源培养基中，以NH4NO3为氮源的菌丝生长最好，其余依次为（NH4）2SO4、NaNO3、KNO3。因此，桑黄菌丝生长的最佳无机氮源为NH4NO3，最佳有机氮源为牛肉膏。
2.3 C/N对桑黄菌丝生长的影响
培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响真菌菌丝的生长繁殖，其中碳氮比（C/N）的影响较大，碳氮比还影响着真菌的活力和寿命。从表1可以看出，当碳氮比为10∶1时，菌丝长势较好，边缘较整齐，菌丝较致密；碳氮比为20∶1时，菌丝长势好，生长茂盛，边缘整齐，菌丝厚实浓密，生长速度快；碳氮比为30∶1时，菌丝长势较差，边缘较整齐，菌丝较致密，但生长速度较快；碳氮比为40∶1～60∶1时，菌丝长势较差，边缘不整齐，但菌丝较致密，生长速度较快；碳氮比为70∶1～80∶1时，菌丝长势较差，边缘不整齐，菌丝稀疏，生长速度慢。因此，综合来看桑黄菌丝生长的最适碳氮比为20∶1。 2.4 pH对桑黄菌丝生长的影响
桑黄菌丝生长对pH的适应范围较广，试验中在pH 4～9内均可生长，但生长速度有明显差异。pH 6时菌丝生长最快，日生长量达到3 mm。pH大于7时菌丝生长速率随pH的增大而减小。表明桑黄菌丝适宜在中性偏酸环境下生长。罗杰等[6]研究了pH对桑黄菌丝生长的影响，结果表明，桑黄菌丝在偏酸性环境中生长较好，其适宜pH为4.5～5.0，研究结果与此次研究相似。而姜明等研究结果表明不同pH的PDA培养基中桑黄菌丝在相同时间内菌丝生长长度是不同的。
2.5 温度对桑黄生长的影响
真菌生长发育分为营养生长阶段和生殖生长阶段。大部分真菌营养生长所需温度基本相近，而生殖生长所需温度差别较大，不同种类的食用菌、同一种类不同品种甚至同一品种不同生长阶段的食用菌生长发育所需的温度也有所不同。温度的高低主要影响食用菌菌丝的生长速度以及子实体的分化数量和质量。由图4可见，桑黄菌丝生长的温度范围在5～40 ℃，最适生长温度为22～28 ℃，25 ℃时生长速度最快。表明桑黄菌丝在不同温度下的生长差异反映了构成菌丝的细胞在不同温度下的生长分裂速度，也是菌丝代谢酶活性的间接反映。与罗杰等[6]报道桑黄菌丝在13～38 ℃的范围内均能生长，最适生长温度为28 ℃的结果基本相符，但存在差异，说明不同菌株对温度的要求不同。
桑黄子实体原基在15～30 ℃均能形成，但子实体原基形成时间长短、数量、长势、大小等都存在比较明显的差异。在15 ℃下桑黄由营养生长转化为生殖生长形成子实体原基的时间较长（25 d）、数量较少、长势一般、大小不均，在20 ℃下形成子实体原基的时间最短（菌丝满袋后10 d形成原基）、数量多、长势强、大小均匀，在25 ℃下形成子实体原基的时间较短（与20 ℃相隔5 d，15 d形成原基）、数量较多、长势较强、大小均匀，在30 ℃下形成子实体原基的时间较长（22 d）、数量较多、长势一般、大小不均，在35 ℃下形成子实体原基的时间最长（30 d）、数量少、长势差、大小不均，在40 ℃下只有零星子实体原基形成。由此可见，桑黄子实体原基形成最佳的温度为20 ℃。
2.6 培养基对桑黄菌丝生长的影响
在不同培养基上桑黄菌丝生长情况存在明显差异（表2）。培养基①上的菌丝生长速度最快，菌丝体淡黄色、新生区分层明显、生长茂盛、厚实浓密、呈毯状，生长速度为7.12 mm/d；菌丝在培养基③上的生长速度与培养基①上的大致相同，但在培养基③上的菌丝体没有PDA培养基上的的浓密，在培养基③上的菌丝长势一般，菌丝生长薄而稀疏，不能覆盖培养基；其次是培养基⑥，生长速度为6.56 mm/d；在培养基⑧上菌丝生长速度最慢，为3.12 mm/d，菌丝发育不良，甚至生长停滞，不适宜菌丝生长，这可能与培养基的营养成分不足有关。赵昊璐等报道以玉米粉作为母种培养基，桑黄菌丝生长速度为5.58 mm/d；姜明等[7]研究表明桑黄菌丝生长的最佳培养基配方为酵母粉1 g，蔗糖4 g，琼脂3 g；吕英华等对秦巴山区产裂蹄木层孔菌（Phellinus linteus）以菌丝日均生长速度为指标，比较了其在玉米粉综合培养基、马铃薯综合培养基、木生菌标准培养基上的生长情况，结果表明，野生桑黄菌在玉米粉综合培养基上的日均生长速度最快，表明不同桑黄菌株菌丝的生长对营养成分要求不同。
3 小结
试验研究了不同的培养基、碳源、氮源、碳氮比、pH及温度等对野生桑黄——火木层孔菌生长发育的影响，筛选出适合桑黄菌生长发育的培养基配方为新鲜桑枝120 g、麸皮50 g、葡萄糖10 g、琼脂10 g，去离子水定容至500 mL和适合桑黄生长的营养培养条件、环境条件。因桑黄所含有的多糖体能激活体内免疫系统，增强抗癌活性、免疫活性，具有明显的抗肿瘤效果，桑黄的需求越来越大，价格越来越高，人工栽培桑黄已成为当务之急。期待着桑黄这一古老的珍贵药用真菌能够早一天大规模进入市场，给人类的健康带来福音。
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