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微课堂|盘点亲和层析介质(二)

中科森辉微球 2020-08-30 16:39:14



亲和层析介质系列的第一篇文章中我们提到:


得益于研究人员对基团特异性反应和生物识别机制的深入认识,近20多年来,合适的载体基质不断开发成功,亲和层析的应用领域不断扩展,并且为大家做了第一个成员的介绍---生物亲和介质(BAFC)。


今天我们的森辉微课堂将继续为大家介绍亲和层析介质的成员之二----免疫亲和层析。

利用抗原抗体中的一方为配体,亲和吸附另外一方的亲和分离系统,称为免疫亲和层析( immunoaffinity chromatography,IAFC)。

免疫亲和层析快问快答




1.IAFC的特点是什么

免疫亲和层析具有特异性好、结合容量大、洗脱条件温和等优点,能从复杂的生物样品中有效分离目标蛋白,因此应用相当广泛。


由于抗体-抗原作用具有高度的专一性,并且它们的亲和力极强,因此用适当的方法将抗原或抗体结合到载体上,便可有效地分离和纯化各自互补的免疫物质。


20世纪70年代末,单克隆抗体的发现在很多方面加速了免疫亲和层析法的发展,重组蛋白(包括重组抗体)的生产,也给这种方法的应用提供了便利条件。许多典型的亲和层析纯化蛋白质的过程已经使用了单抗作为亲和配体。目前,利用抗体抗原模式,有可能得到每一种目标蛋白的单抗,然后以单抗为配基,通过亲和层析技术分离纯化目标蛋白质。此种方法的纯化倍数、活性回收率都非常高。



2.IAFC都有哪些应用?

1)蛋白A亲和介质和蛋白G亲和介质是应用广泛的免疫亲和层析介质。以蛋白质A和蛋白质G作为配体(它们是分别存在于葡萄状球菌和链球菌表面的两种蛋白质)。虽然其氨基酸序列不同,但都可以与免疫球蛋白的恒定区相结合。是分析人类免疫球蛋白,特别是IgG类抗体的很好的免疫亲和层析的配体。


2)免疫亲和层析法在分析检测中也应用非常广泛。用免疫层析柱进行各种类型的免疫检测被称为免疫检测法,特别适用于检测含量低微的样品。免疫检测法利用被标记的抗体或模拟分析物来进行间接的被分析物的分析。常用标记如酶标记、荧光标记、化学荧光等。



3.IAFC是如何合成的?

正如大家所熟知的,免疫亲和柱的制备方法一般是将纯化后的抗体(抗原)结合在层析载体上。


在这里向大家介绍一种固定重组抗体的方法【1】, Kerstin等人构建了一个表达具有多个几丁质结合部位(CBD)的scFV片段融合蛋白的质粒,因此可以直接将溶菌酶粗提液固定于成本较低的几丁质珠粒上。


该法的优点在于:①充分利用了现代信息库技术,运用了易于在E.coli中大量表达的scFV片段,而不像单克隆抗体的生产,既费时,成本又高;②利用scFV片段的CBD,scFV融合蛋白的偶联不需要固定化操作,这就意味着抗体的结合量不会有所损失;③在偶联之前不需要其他的纯化步骤。



结语

以上就是亲和层析介质系列《那些年,我们用过的亲和层析介质》的第二部分,查看其他系列文章,请戳

微课堂|盘点亲和层析介质(一)




参考文献 

【1】 Blank Kerstin, Lindner Peter, Diefenbach Beate,Pluckthun Andrreas. Self-immobilizing recombinant antibody fragments for immunoaffinity chromatography:generic,parallel,and scalable protein purification.Protein Expression and Purification,2002,24:313-322.


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