“蛋白表达”疑难解惑第八弹:昆虫表达。
Q1
检查您的载体序列(ATG起始密码子,读码框的一致性,等等)。
如果您的载体包含N端或C端标签,这些序列可能会影响RNA结构和降低翻译水平。可尝试去除融合标签或其他末端序列。
请确保DNA模板的纯度,且不含酒精、钠盐、乙酸铵或RNA酶等污染物。
不要使用琼脂糖凝胶中纯化出的DNA,它们会抑制表达反应。
我们推荐您在2 mL的蛋白合成反应体系中使用10–15 µg的模板DNA。如果您表达的蛋白分子量较大,则可将蛋白合成反应中的DNA模板用量增至20 µg。
请确保使用恒温混匀仪或带有振荡功能的孵箱来进行反应,请勿使用不带振荡功能的孵箱或水浴。
多次补料有助于提升蛋白得率。在蛋白合成反应起始后,您可通过更频繁地以小体积多次向样本加入补料缓冲液(feed buffer),来代替在反应初始阶段的30分钟时间点进行一次性补料的操作(即在3小时的时间内,每隔45分钟就向1 mL样本总加入0.25 mL补料缓冲液)。
Q2
我的蛋白形成了聚集物。我该如何处理?
Q3
我的对照组反应不成功。我该如何处理?
Q4
我获得的蛋白得率不错,但其生物活性很低。我该如何处理?
您的蛋白可能未正确折叠:请尝试在蛋白合成过程中将孵育温度降低至25°C。
您可能需要对蛋白进行翻译后修饰:Expressway™系统不会为重组蛋白进行翻译后修饰。
您所合成的蛋白可能需要辅助因子才能发挥全部活力:因此请尝试在合成反应中加入所需的辅助因子。
Q5
使用Expressway™系统反应后,在跑胶时我观察到小分子量产物形成了一条梯带。怎么会发生此种情况?
Q6
未使用丙酮来沉淀样本:使用丙酮来沉淀蛋白将帮助去除背景弥散情况。
蛋白上样量过多:减少蛋白样品的用量。
凝胶自身不够干净:在胶片曝光之前对凝胶进行简单的润洗
蛋白合成反应中包含乙醇:请确保在DNA纯化过程中去除了残留的乙醇。
检查预制胶的保质期:请勿使用过期的凝胶产品。
Q7
在使用MembraneMax™试剂盒的过程中,我获得的蛋白得率很低或完全不表达。这可能是由什么原因所导致的?
请检查您DNA模板的构建(ATG起始、标签、终止密码子、阅读框等等)。
请确保DNA模板的纯度。
请勿通过凝胶纯化法来抽提您的DNA,使用这样的DNA会抑制蛋白合成反应的进行。
请确保使用正确的DNA模板用量;我们推荐您在2 mL蛋白合成反应中使用10–15 µg模板DNA。
请使用恒温混匀仪或带有振荡功能的孵箱进行蛋白反应。
请确保使用正确剂量的MembraneMax™试剂。
尝试不同的“补料(feed)”时间表——例如在蛋白合成起始30分钟和1个小时的时候,向样本中加入1/2体积的补料缓冲液(即向50 µL样本中加入25 µL补料缓冲液)。
如需表达较大的蛋白,请尝试在合成过程中将孵育温度降至25–30°C。
蛋白可能发生降解;将孵育时间限制在2小时之内,并在反应步过程减少操作步骤。
Q8
我能将我的MembraneMax™反应孵育的时间延长至2小时以上么?
是的,您可将孵育时间延长至4小时以尝试增加蛋白得率,不过这一操作也可能导致形成多分散的胶团结构。由于两小时的孵育时间通常就能在多种蛋白上获得75%以上的表达效率,因此通常并不必要使用更长的孵育时间。您可尝试通过提升孵育温度来增加翻译速度,或通过降低温度来为蛋白正确折叠提供更长的时间。注意,请勿将温度降低至24°C以下,这是MembraneMax™试剂中DMPC脂质双分子层的转变温度。对补料时间表进行调整可能有助于提升您的合成反应效率。举例来说,您可尝试以50%的反应体积来起始反应,之后以30分钟的间隔两次加入25%反应体积的补料缓冲液。最后,您可按比例增加反应体系,以获得更大量的膜蛋白,因为蛋白得率通常是反应/体积依赖的。
Q9
尽管我能通过MembraneMax™试剂盒获得蛋白,但蛋白自身的生物活性很低。这可能是由什么原因所导致的??
???
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一只馄饨1分钟前
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封面图及部分文字图片来自:视觉中国。
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