终于等到你 | 新一代革命性蛋白质组定量分析技术DIA

如果有一种技术能够将样本的生物信息完整地保留下来，并且你在不同时间采集的样本的数据，都可以放在一起进行比较分析，是不是有点科幻的意味？发表于顶级学术期刊《Nature Medicine》 （IF=29.8）的研究宣布，在蛋白质的生物样本分析领域，现在梦想已经照进现实。

Nat Med. 2015 Apr; 21(4): 407–413.

对生物样本而言，每进行一次分析就是一次样本损耗，并且即使是低温条件，长时间保存也会造成信息改变。因此，生物样本算是一种不可再生资源。该研究基于一种全新的质谱技术——Data-Independent Acquisition (DIA)，为我们带了一种能够将生物样本中的大量蛋白质信息高效地转化数字信息的方法，以实现蛋白信息的永久保留和分析。

具体分析流程，如下图所示：

该方法体系由样本制备和质谱数据采集两个主要步骤组成。样本制备采用的是pressure cycling technology (PCT)法。简单来说，PCT法就是通过程序性地对样本施加超高压力，实现蛋白质和基质的解离。其优点是，在提高提取效果的同时，减少化学试剂、高温对样本的影响。在常规PCT方法上，研究者进行了进一步地优化，使其更适用于蛋白质组样本的提取，并且在整个过程中尽可能实现各提取步骤的无缝对接，以减少样本转移过程，实现尽可能高的平行性。方法评价结果表明：每百万细胞能够获得116ug肽段，每mg肾脏组织能够获得50ug肽段，其得率比传统方法提高40%；并且技术重复的CV<8%。

什么是DIA技术？

传统的蛋白质组质谱分析技术，如大家最了解的shotgun、label free、iTRAQ/TMT等，是无法实现该目的的。因为，传统的蛋白质组技术在数据采集过程中存在较高的数据丢失和采集的随机性。简单来说，传统方法采用了一种叫做DDA（data-dependent acquisition）的采集方式。在这个采集过程中，每个扫描周期内，质谱只对丰度最高的几个信号（一级质谱）进行二级信号采集（二级质谱），其余信号的二级信号则丢失了（如果没有二级信号，就无法知道这个信号是什么蛋白质，也就没有意义了）。就好比，传统的蛋白质组采用的DDA是一种机关枪扫射的模式，一轮扫下来，打到的都是那些比较显眼的敌人。同时，大家可以想象，机枪扫射闭着眼睛一阵疯狂，所以有时候会击中这些目标，有时候会击中那些目标，具有较高的随机性。

而本文采用的DIA（data-independent acquisition）技术，。其原理是，将所有的信号预先划分为几块，然后对每块区域里面的所有一级信号，全部一次性进行二级采集。好比，我们先对敌军区域进行划分，。所以一顿轰炸下来，基本敌人就全歼灭了。而且无论重复来几次，都是基本全歼，从而实现了高度的覆盖性，以及在此基础上的高度重现性。

DIA技术的优势

1. DIA提升了单次分析的数据量：例如，下图中组织样本的DDA鉴定到的peptide数量约16000，DIA数量约28000

2. DIA减少了每次采集的数据缺失、空值，提高了鉴定重现性

3. DIA提升了定量的稳定性

4. DIA提升了定量的准确性

5. DIA获得更多低丰度蛋白的数据

DIA技术的应用

目前，DIA技术更广泛的应用，目前更多的还是学术研究领域，传统蛋白质组学的应用方向，均适合采用DIA技术。

瑞士的苏黎世大学医院等诸多医学机构已经开始利用DIA技术，对数千甚至数万例癌症样本进行生物信息的数字化，构建肿瘤样本的生物数字库，为精准医疗研究奠定基础。

鉴于DIA技术在完整性、重现性方面的优势，除了上述样本数字化方面的应用，其尤其适用于：

1. 标志物研究：发现和初步验证阶段，都可以用DIA来完成。

2. 品系、表型比较： 除了定量更准确，DIA的重现性和完整性则会极大地减少数据采集本身造成的信息缺失问题，更真实反映样本间的差异。

中科新生命作为质谱分析行业的领航者，10多年分析和服务经验的老司机。这么好的技术，我们当然要为大家提供！！！中科新生命提供全新的DIA解决方案：

在仪器方面：APT采用基于Orbitrap质谱的DIA技术，其优势包括：分辨率更高，对复杂样品定性定量准确度高； 质量轴长期稳定，稳定性更好；快速扫描下的灵敏度更高，谱图质量高；动态范围及线性范围更宽。

在软件方面：APT采用目前最优秀的DIA软件，可实现了超过1000个DIA原始文件同时分析、一键式操作、极高谱图解析率、平均峰面积CV<10%等。在顶级方法学研究学术期刊《Nature Biotech》（IF= 41.6）上发表的研究（doi:10.1038/nbt.3685），比较了目前常用的DIA-MS软件，结果表明：无论是准确度、灵敏度还是速度，Spectronaut均排名第一。

在此基础上，APT通过对色谱条件、质谱参数的优化，实现了更高的分析能力，例如血样样本，即使不去除血液高丰度蛋白，也可实现DIA鉴定数量近700个 protein group！

中科新生命提供完整的蛋白质组解决方案，包括传统的DDA分析（iTRAQ/TMT、Label free、SILAC）和新一代的DIA分析。超过10年分析和服务经验，为您从实验设计到技术选择，提供最优设计方案，最可靠分析结果。