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运动在体内代谢稳态中起着至关重要的作用，它是预防和治疗某些代谢障碍的较为有效的疗法。随着蛋白质组学技术的发展，越来越多的研究者将蛋白质组学运用于运动人体科学领域的研究，从整体水平研究蛋白质组在运动过程中的变化规律。
2015年，Nolan J. Hoffman等人在国际著名期刊Cell Metabolism上发表其研究成果，研究者采用磷酸化蛋白质组学方法进行定量分析，揭示运动所调控激酶的信号网络，同时证实了磷酸化修饰对线粒体呼吸关键信号的调节作用[1]。
近日，该实验室研究结果再次登录Cell Metabolism，研究者在前期的研究基础上，运用高通量蛋白质组学的技术方法，对运动过程中的细胞外囊泡(EV)展开研究。研究结果揭示了运动过程中组成细胞外囊泡的蛋白显著增加，并且有倾向的在肝脏中定位，并与其他器官或细胞间进行物质交流。研究结果为运动疗法发挥系统生物学效应提供了数据支撑。
细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，简称EV），是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡结构统称，EV直径可以从30、40nm到8、9um。根据EV的生物合成或释放途径的不同，EV可分为不同的亚群，目前研究最火热的是外泌体这个亚群。
外泌体(Exosomes)直径为30-150nm，起源于内吞途径，其密度约为1.11-1.19g/mL，外泌体蛋白质组学研究的学术价值和典型案例，可点击：外泌体蛋白质组／修饰组学服务。
1.样本处理与分组
首先研究者分别从11个健康男性的股动脉的内室套管中采集血浆样品，样品分为三组：rest组、exercise组和recovery 组。
Rest组：运动前取自股动脉的内室套管中；
Exercise组：取进行60min运动后的血浆；
Recovery组：取自停止运动后4小时的血浆样本。
图1 样本采集与分组
2．定量蛋白质组学鉴定样本中蛋白
研究者通过label-free定量蛋白组学，从样本中鉴定到5,359个蛋白质(图2) 。相对以前127位研究者的研究结果，此次鉴定到的蛋白质结果覆盖度更广，且鉴定到2780个蛋白以前在EV蛋白质组学中未被报道(图2A) ，且有3319个蛋白高度一致(图2B)。
通过纳米粒子跟踪分析和低温电子显微镜方法，研究者也同样鉴定到50-350nm大小的囊泡。同时，也检测了一些已知的细胞外囊泡标志物蛋白：TSG101, CD63等（图 2D）。更重要的是，通过SignalP对所有氨基酸序列分析，只有16.3%有预测的信号肽，这意味着一大部分被释放到血液循环中的囊泡是没有信号肽的。
图2 样本中蛋白质的鉴定与定量
3. 差异蛋白分析揭示运动过程机理
研究者分析不同样本间差异，发现Exercise组和Rest组有322种蛋白质发生显著差异，而Rest组和Recovery 组间只有三种蛋白质存在显著的差异，说明了EVs蛋白丰度的变化在运动过程中是瞬态短暂的。同时，运动后一大部分上调的蛋白是构成细胞外囊泡的蛋白(Figure 3A) 。对样本的纳米粒子跟踪分析揭示了运动后囊泡粒子显著增加，同样也验证了这一结果。
对差异蛋白的GO分析表明：运动后蛋白主要富集在与细胞内起源有关的内体腔室、丝状体和纤毛。基于分子功能和生物学进程分析发现，显著上调的蛋白主要富集在信号转导、免疫调节细胞增殖，尤其是在是G蛋白信号和GTPase信号通路，同时糖酵解过程被显著富集，一些糖酵解过程的酶受运动循环调节。
图3运动后构成细胞外囊泡的蛋白显著上调
4. SILAC脉冲追踪实验揭示EV蛋白转移至肝细胞中
研究者最后采用SILAC脉冲追踪实验，结合定量蛋白质组学方法，进一步研究渗入到肝脏细胞中的EV蛋白，研究流程如图4所示。
图4 SILAC脉冲追踪实验流程
作者分别用运动小鼠体内分离的外泌体、不含质膜的囊泡以及对照组PBS处理培养的AML12肝脏细胞4h，随后对细胞进行蛋白质组学分析，总共鉴定到6531个蛋白。其中使用EVs处理的细胞检测出来了很大比例的重度标记的蛋白，表明囊泡蛋白发生了转移。小鼠运动后囊泡蛋白显著富集在囊泡、溶酶体、质膜等细胞起源的器官中，表明运动刺激了机体的循环，增加了细胞外囊泡的分泌，并由其转移到活体肝细胞中。肝细胞中由囊泡引起的粘附蛋白，比如四分子交联体家族蛋白以及整合蛋白，这些蛋白质与囊泡受体细胞相互作用有关。
图5 运动中EVs中在肝脏富集
研究者运用采用定量蛋白质组学技术，来表征运动诱导的EV包含蛋白的分泌过程。通过对健康受试者血浆样本在运动前、运动中和运动后的蛋白质表达谱的对比与分析，研究者揭示了运动后组成细胞外囊泡的蛋白显著增加，运动促进了细胞外囊泡的分泌，并且有倾向于在肝脏中定位，并与其他器官或细胞间进行物质交流。
参考文献：
Nolan J. Hoffman., et al.（2015）Global Phosphoproteomic Analysis of Human Skeletal Muscle Reveals a Network of Exercise-Regulated Kinases and AMPK Substrates. Cell Metabolism.
R., James, D., et al (2018). Extracellular Vesicles Provide a Means for Tissue Crosstalk during Exercise. Cell Metabolism
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