今天是六一儿童节，活性蛋白宝宝也来凑热闹啦！ 怎么检测呢？往下看......
活性蛋白是生物诊断分子和生物药的真正有效成分，但是一直缺乏基准方法（primary method）进行检测，常用的分光光度法、比色法甚至ELISA都不适合成为标准的检测方法，主要原因就在于这些方法都是基于一级序列的检测，而不是真正的检测活性蛋白。近几年，基于SPR的无标曲检测法（CFCA calibration-free concentration analysis）可用于蛋白样品的有效活性浓度检测，这种方法直接检测有效互作的分子，无需进行复杂的样品处理和方法建立，无论在基础科研还是制药行业都已经被广泛应用。在本期微信稿中，小编会以北京化工大学、国家计量院以及中国农业科学院合作发表的文献利用Biacore T200进行了CFCA检测，详细将CFCA的检测方法进行了描述和比较。
CFCA方法简介
Biacore检测是将配体固定在芯片表面，分析物流经芯片表面。在这个过程中，分析物的浓度收到物质迁移速率的影响。物质迁移速率（样品流经芯片表面，在流路管道垂直方向的迁移速率）直接可由流路通道的体积，物质的扩散系数，以及初始分析物的流速计算而得。CFCA检测可通过分析物以两种流速流经芯片表面，通过物质迁移速率的计算仪器自动拟合出分析物的浓度（更详细的内容参见参考文献）。
分析物在流路管路中由溶液向芯片表面垂直扩散
配体固定量对CFCA检测的影响
本文检测的样品为标准品G2-EPSPS（50094 Da）和其抗体（150 kDa）。将抗体作为配体直接偶联在CM5的芯片上，配体分别偶联35，60，80，110 RU/kDa，用于检测不同配体偶联量对浓度测定的影响，分析物G2-EPSPS稀释三个不同浓度进行检测。当偶联密度小于35 RU/kDa时，变异系数CV值非常大达到了96.29。除此之外，Biacore T200 QC值小于0.2，此值表示结合阶段受物质迁移效率的影响，正常的浓度检测过程中，QC值应该大于0.2。当偶联密度达到110 RU/kDa时，检测的CV值只有3.74，QC值都大于0.2，可见配体高偶联有利于蛋白活性浓度的检测。
不同配体偶联量的检测传感图
CFCA方法的评价
为了检测此方法的优劣，分析物稀释三个浓度分别都检测三次，分三天进行检测。结果表明，一天内的检测精确度在3.26%-4.58%，三天内的检测请确度在8.36%。此结果说明了此方法的可靠性和可重复性。用CFCA第一天的检测浓度为2778.6 nM, 而用IDMS(isotope dilution mass spectrometry)检测的浓度为15592.67 nM, 说明有效活性蛋白浓度只有17.82%，只占G2总蛋白的一小部分。
总结
IDMS检测到的蛋白浓度远远大于CFCA法检测的活性浓度，而蛋白浓度的准确性直接影响对蛋白药物或诊断分子性质的判断，因此蛋白活性浓度的检测非常重要。文章从CFCA方法的建立以及多天多次数据的比较充分说明了Biacore CFCA 无标曲浓度检测的可靠，简单和精准。在实际工作中recovery rates也是大家非常关心的数据，此试验建立的CFCA法的recovery rates为97.46-104.34%，也说明了此方法的精确和良好重复性（此数据可参考原文）。CFCA检测法可以清晰的用方程式表示，因此结果也可用SI(Systeme International) unit表示，而且检测结果也精准，可重复，这使CFCA成为活性蛋白浓度检测的基准方法（也就是标准参考方法）成为可能。
参考文献：
1、Ping Su，Zhangjing He et.al., SI-traceable calibration-free analysis for the active concentration of G2-EPSPS protein using surface plasmon resonance. Talanta 178 (2018) 78–84.
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