“蛋白表达”疑难解惑第六弹。
Q1
若要在大肠杆菌中同时表达2种蛋白，我们建议使用双启动子载体或同时使用2种不同的可兼容的载体。
例如，您可尝试同时使用1个pET载体和1个pRSET载体，它们含有不同的复制起点（ORI），分别为pBR322和pUC复制起点。唯一的问题是，pRSET载体是高拷贝数的，而pET不是；因此，如果您将它们转化到同一个宿主细胞中，从pRSET中得到的蛋白表达可能明显多于pET。
Q2
你们是否可提供带有标签的细菌表达载体，同时，该标签可从重组蛋白上切割下来并且不留下任何残余氨基酸？
我们推荐Champion™ pET SUMO蛋白表达系统（货号K300-01）。将目的基因克隆和表达为融合有SUMO标签的蛋白。使用SUMO蛋白酶切割SUMO，可得到在切割位点与蛋白起点之间无残余氨基酸的天然蛋白质。
Q3
我的细菌表达实验没有得到菌落。我该怎么办？
检查所用的抗生素
转化pUC19对照载体，检验感受态细胞。
如果目的基因具有毒性，并且启动子为T7启动子，可尝试使用BL21 (DE3) (pLysS)或(pLysE)或BL21 (AI)感受态细胞。您也可尝试在培养基中加入葡萄糖。
Q4
我的蛋白质溶解性存在问题。你们有何建议？
降低诱导温度至30°C、25°C或18°C，有助于增加溶解性和减少包涵体形成。温度越低，诱导所需时间越长（即，30°C需3-4小时，25°C需3-5小时，18°C需过夜）。
在较高温度下生长（30°C或37°C）并达到合适的OD，加入诱导剂，然后降低温度。
尝试不同剂量的IPTG（1 mM-0.1 mM IPTG）。
使用低拷贝数的质粒。
使用营养不丰富的培养基，例如以M9基本培养基代替LB。
如果蛋白质需要辅因子，如金属，则在培养基中加入辅因子。
增加葡萄糖至1%。
尝试使用BL21-AI菌株并使用不同剂量的阿拉伯糖。
Q5
我的细胞生长非常缓慢，也没有得到任何蛋白表达。我该如何解决这个问题？
Q6
进行蛋白纯化时，在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，如PMSF。使用新鲜配制的PMSF，因为PMSF被稀释到水溶液中后30分钟内会失效。
如果您在表达实验中使用氨苄青霉素进行筛选，则可能会因为筛选条件缺失而出现质粒不稳定。这是因为氨苄青霉素被β-内酰胺酶破坏，或者在由细菌代谢物造成的酸性培养基条件下发生水解。在转化和表达实验中，可使用羧苄青霉素替代氨苄青霉素。
重组蛋白可能对细菌细胞具有毒性作用。应选择更严格调控的系统用于表达，如BL21-AI。也可考虑尝试使用不同的表达系统，如pBAD系统。
Q7
如何能够知道蛋白质发生降解或者存在密码子使用偏好？
通常，如果您看见1-2条主带，则表示密码子使用偏好导致了翻译过早终止。发生降解时，通常可看到梯度条带。发生降解时，可尝试在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂有助于防止降解。如果是这种情况，可通过时间点实验来确定收细胞的最佳时间。
Q8
我的目的基因对细菌细胞有毒性作用。可采取哪些预防措施？
有多种措施可防止由毒性基因本底水平表达带来的问题。这些方法均基于T7或Champion™表达质粒的设计和构建是正确的：
在不含T7 RNA聚合酶（即，DH5α™）的菌株中繁殖和维持表达质粒。
如果使用BL21 (DE3)菌株，应在室温而非37°C下生长24-48小时。
新鲜转化严格调控的大肠杆菌菌株，如BL21-AI™菌株。
转化实验后，将转化反应接种在含100 μg/mL氨苄青霉素和0.1%葡萄糖的LB板上。葡萄糖可抑制T7 RNA聚合酶的本底表达。
完成BL21-AI™菌株的转化后，挑选3或4个转化株直接接种到新制备的含100 μg/mL 氨苄青霉素或50 μg/mL 羧苄青霉素（以及0.1%葡萄糖，如果需要的话）的LB培养基中。当培养物的OD600值达到0.4时，可加入终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖来诱导重组蛋白的表达。
在表达实验中，在生长培养基中补充0.1%葡萄糖和0.2%阿拉伯糖。
尝试使用调控型细菌表达系统，如我们的pBAD系统。
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