（导读）外泌体携带有来源于细胞的大量分子信息和丰富的膜蛋白，分析鉴定外泌体表面的膜蛋白标记是新兴的无创性肿瘤辅助诊断方法，为肿瘤生物标志物的鉴定提供了强有力的手段。现在有一种新的传感器平台，利用核酸适配体保护和识别的双重作用，将核酸适配体与纳米金结合，在几分钟内就能通过肉眼分析外泌体表面蛋白表达谱，还可进行蛋白表达定量。这种方法非常适用于大规模高通量筛选，特别是临床标本分析检测和肿瘤生物标志物筛选，使癌症早期非侵入性检测成为可能。
我们平时见到的蛋白表达谱分析结果是不是都是这样？
（图片来源：He S, Zhao J, Song S, et al. Viral pseudo-enzymesactivate RIG-I via deamidation to evade cytokine production [J]. MolecularCell, 2015,58(1): 134-146.）
或者这样？
（图片来源：Chen CY, Rao SS, Ren L, et al. Exosomal DMBT1 from humanurine-derived stem cells facilitates diabetic wound repair by promotingangiogenesis [J]. Theranostics, 2018,8(6): 1607-1623.）
最近看到一个很独特的蛋白表达谱分析结果，迫不及待想把这篇文献拿来与大家分享！这个热图是这样的：
敲可爱的蛋白谱分析啊！感觉整个人都萌萌哒啦！妈妈再也不用担心我的结果是红配绿啦！在万千文献海洋之中弱水三千我只想取这一瓢文献！求知欲已经饥渴难耐，让我们一起来学习一下吧！
不仅实验结果使人心旷神怡！而且还发了高分文章呢！科研中最令人神往的境界也莫过于此了。仔细一看，哇居然又是蹭了外泌体这个热点。
外泌体是直径30–100纳米的膜囊泡，可以由多种类型细胞分泌产生，携带有来源于细胞的大量分子信息和丰富的膜蛋白。分析鉴定外泌体表面的膜蛋白标记是新兴的肿瘤无创性辅助诊断方法，为肿瘤生物标志物的鉴定提供了强有力的手段。
如何精准地分析鉴定外泌体表面蛋白呢？质谱？酶联免疫吸附（ELISA）？No no no. 不说太low，只是这些方法需要费时费力来做样品预处理，限制了它们作为外泌体生物标志物快速筛选的简便方法。纳米等离子体传感？也no no no，因为这需要专门的设备，而且分析程序太过复杂。本文的研究团队建立了一个理想的传感器平台，在几分钟内就能通过肉眼分析外泌体表面蛋白表达谱。我是不是看错了？几分钟？肉眼就能分析？多看了几十遍，确认并没有看错。不是我厉害，看完文章你也可以做到。
制备过纳米金的人都知道，单分散的纳米金颗粒在溶液中逐渐聚集会伴随着溶液从红色到蓝色的颜色变化，可以此为标准，一秒判断自己制备的纳米金颗粒单分散性是否良好。本研究团队的火眼金睛正是看中了这个颜色变化的特点，在此基础上还搭配了一个黄金法宝——核酸适配体。核酸适配体是通过SELEX富集技术体外筛选得到的寡核苷酸片段，不仅能与蛋白多肽高特异性地结合，而且它们与纳米金颗粒吸附后能够保护纳米金颗粒分散于盐离子溶液中稳定不聚集。
在外泌体的存在下，如果外泌体表面蛋白质能与选定的核酸适配体发生特异性结合，这种较强的特异性结合就会破坏纳米金颗粒与核酸适配体之间较弱的非共价结合。失去了核酸适配体的保护，纳米金颗粒在盐溶液中发生聚集，导致溶液颜色的变化，产生外泌体表面蛋白谱的识别模式。是不是听起来很简单！简单就对了！这种理想的传感器检测平台追求的就是快速高效！
当然，作为一个科研学者，除了追求快速高效，对于传感器还有精确度的要求。这个传感器平台到底准不准呢？数据说明一切。这篇文章选取了一个普遍存在于外泌体中的标志蛋白CD63，筛选出CD63的核酸适配体后将其与纳米金非共价结合，同时还从DNA文库中任意筛选了一段核酸适配体也将其与纳米金结合。向这些溶液中加入超速离心法获得的外泌体（来源于Hela细胞）前后，观察溶液颜色变化。
结果发现，只有CD63核酸适配体修饰的纳米金颗粒遇到外泌体时，或者纳米金颗粒没有任何修饰保护、稳定性不够强时，纳米金颗粒才会聚集，溶液颜色由红变蓝。单独纳米金颗粒+外泌体、任意核酸适配体修饰的纳米金颗粒、任意核酸适配体修饰的纳米金颗粒+外泌体、CD63核酸适配体修饰的纳米金颗粒都不会发生颗粒聚集，也不会发生颜色变化。这样就证明了没有什么无关因素可以干扰实验分析，而且外泌体表面蛋白与相应核酸适配体结合的特异性是非常有保障的。这个结果还更精确地在紫外可见光谱仪上做了验证，纳米金颗粒聚集时650nm处溶液吸光度数值显著增高。哎呀看到这里我不禁一拍脑袋，这样的话不就可以通过比色法用吸光度数值对纳米金颗粒聚集程度做定量分析，来以此定量外泌体中特定蛋白的含量了吗！！！既能用肉眼快速观察结果，也能以比色法做蛋白定量，精不精确！可不可行！方不方便！
经过检测，吸光度值A650/A520被选用作为最合适的蛋白定量分析指标。不同细胞系来源的外泌体CD63表达量不同，为了验证我们用吸光度数值定量分析蛋白表达的猜想是否可行，从Hela、PC-3、CEM、Ramos细胞系中提取的CD63含量不同的外泌体被用来做了比较。从结果中可以看出，虽然这四种细胞系来源的外泌体都可以与CD63特异性结合引起纳米金颗粒聚集溶液颜色变化，但是不同含量的CD63引起金颗粒聚集的程度不同，颜色变化不同，比色结果也不同。太好啦！用比色结果来反映外泌体特定蛋白含量的想法确实是可行的！
秉承严谨的科学态度，再验证一次传感器的特异性吧。作者选择了只在CEM细胞系外泌体中高表达的PTK7蛋白，将其核酸适配体连接于纳米金颗粒上，再分别加入来源于CEM细胞系和Ramos细胞系的外泌体，发现只有源于CEM细胞系的外泌体会引起溶液颜色和吸光度的变化，而不含PTK7蛋白的Ramos外泌体则没有引起溶液吸光度的显著变化。
到此为止，一个可以分析外泌体表面蛋白表达谱的传感器平台诞生啦！迫不及待地想要试试看，那就来鉴定分析一下四种细胞系来源的外泌体表面CD63、EpCAM、PDGF、PSMA、PTK7这五种标志物的表达含量吧。以吸光度为指标，将结果化归之后，一个萌萌哒的蛋白表达热图就诞生啦！红色高表达，绿色低表达，一眼就能看出结果！就算不做定量分析，也能用肉眼直接观察纳米金溶液的颜色来判断蛋白表达量。新技能！get！
好啦，我们好像明白了点什么，分析外泌体表面蛋白只需几步轻松搞定：
1 SELEX富集筛选标志物蛋白核酸适配体
2 将核酸适配体与纳米金颗粒非共价结合
3 提取外泌体
4 将外泌体加入制备的纳米金溶液中
5 肉眼观察颜色变化 or 比色法检测吸光度定量分析
这种策略巧妙利用了核酸适配体保护和识别的双重作用，非常适用于大规模高通量筛选，特别是临床标本分析检测和肿瘤生物标志物筛选，使癌症早期非侵入性检测成为可能。
萌萌哒的图看完了，文章也说完了，11分文章轻松拿下。是不是很简单！别整日沉迷于养细胞、跑WB、PCR、做ELISA了，也不用太过于依赖质谱色谱冷冻电镜这些高精尖技术，换一个思维，转一个角度，满足自己的审美，快快乐乐做实验，开开心心发文章！来一场没有套路的走心科研！
参考文献：
Jiang Y, Shi M,Liu Y, et al. Aptamer/AuNP Biosensor for Colorimetric Profiling of ExosomalProteins [J]. Angewandte Chemie, 2017,129(39): 11916.
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