癌症系列报道(九):RNA-蛋白结合与表观遗传和甲基化

在人类细胞中，大多数mRNA（或前体mRNA）与核不均一性核糖核蛋白(hnRNP)相结合，形成大的hnRNP-RNA复合物。hnRNP蛋白在RNA加工的所有关键环节中发挥作用，包括前体mRNA剪接以及mRNA出核、定位、翻译和稳定性。几十种RNA结合蛋白（RBP）和基因的hnRNP蛋白与癌症相关联。

RNA-蛋白的相互作用可通过交联免疫沉淀测序（CLIP-Seq）来测定。在CLIP-Seq中，细胞经过紫外线处理，让RBP与RNA复合物共价交联。细胞随后被裂解，RBP-RNA复合物被免疫沉淀，RNA被测序。

参考文献：

Wilbert M. L., Huelga S.C., Kapeli K., Stark T. J., Liang T. Y., et al. (2012) LIN28 binds messenger RNAsat GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance. Mol Cell 48: 195-206

LIN28 是个保守的RNA 结合蛋白，与多能性、重编程和肿瘤形成相关。在各种不同的癌细胞和原发肿瘤组织中都发现LIN28的异常上调。在这篇文章中，作者利用CLIP-Seq来鉴定分布于四分之一的人类转录本中LIN28的结合位点。这些位点表明，LIN28与mRNA中富含环结构的GGAGA序列结合。他们还发现，LIN28的表达导致可变剪切中广泛的下游变化。

Illumina 的技术：IlluminaGenome Analyzer II 系统，RNA-Seq和smallRNA-Seq，TruSeq试剂盒标签

表观遗传和甲基化：

癌症发展过程中的表观遗传改变与异常的基因表达相关联。近期的证据表明，表观遗传改变可能在癌症起始中发挥作用。表观遗传控制是通过多个过程介导的，包括DNA修饰（甲基化或乙酰化），组蛋白修饰和核小体重塑。控制表观基因组的基因发生突变，在人类癌症中相当普遍。新一代测序提供了一整套工具，可定位突变并测定它们对癌症发展的影响。

癌症中表观遗传修饰物的基因突变。在不同类型的癌症中经常观察到三类表观遗传修饰物发生突变，这突出了遗传学和表观遗传学之间的串扰。表观遗传修饰物的突变有可能引起癌症的全基因组表观遗传改变。了解遗传和表观遗传变化的关系将为癌症治疗提供新的见解。

DNA修饰：

DNA修饰可通过多种技术轻松测定。技术的选择取决于所需的通量和分辨率。

实验设计上的注意事项：

每种组织和细胞类型都有着独特的甲基化模式；因此必须获得感兴趣的组织以便分析。肿瘤组织-癌旁正常组织的配对可简化分析。

亚硫酸氢盐测序所产生的超大量CpG标志物很难解释，且可靠的统计学分析仍然困难重重。不过，下面一些实际的方法可简化分析：

• RRBS-Seq 通过限制覆盖度而简化分析。

• 综合分析大大改善了结果的可解释性。例如，将表达分析与甲基化分析相结合，让研究人员可专注于表达水平改变的基因。

• 将分析限制在某个感兴趣的基因或区域。这种方法对GWAS的后续研究很有效，也适合已有实验证据说明目的区域存在基因调控或染色质重塑的研究。与降低代表性的方法不同，这种方法实现了更多区域的分析，因此可获得更多信息。

组织培养物应当谨慎使用。随着时间的推移和组织增殖，培养物的甲基化水平可能已经改变，不大能代表原先的组织样本。

组蛋白修饰（甲基化）

组蛋白修饰通常指的是甲基化和乙酰化。组蛋白H3K9、H3K27 和H4K20 的甲基化与基因转录的抑制相关，而H3K4和H3K36的三甲基化与活性转录的染色质相关。组蛋白乙酰化几乎总是与染色质可接近性和转录活性水平的增高相关。通过操控染色质状态和DNA可接近性，表观遗传修饰在各个发育阶段、组织类型和疾病中都对基因表达的控制起着关键作用。

参考文献:

Wilkinson A. C.,Ballabio E., Geng H., North P., Tapia M., et al. (2013) RUNX1 is a key targetin t(4;11) leukemias that contributes to gene activation through an AF4-MLLcomplex interaction. Cell Rep 3: 116-127

这篇文章报道了一种转化机制，其中两个致癌融合蛋白合作激活目的基因，然后调节其下游产物的功能。

Illumina 的技术：GenomeAnalyzerIIx 系统或HiSeq2000 系统，ChIP-Seq

实验设计上的注意事项：

每种组织和细胞类型都有着独特的甲基化模式；因此必须获得目的组织以便分析。肿瘤组织-癌旁正常组织的配对可简化分析。

组蛋白修饰可以通过各种ChIP-Seq 方法检测的，原理是通过抗体与目标甲基化组蛋白特异结合。目前市场上出售多种甲基化的组蛋白。

组织培养物应当谨慎使用。随着时间的推移和组织增殖，培养物的甲基化水平可能已经改变，不大能代表原先的组织样本。

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