蛋白电泳干货集中营 | 你选对蛋白凝胶了吗?

不知道大家是否还记得我们上期介绍的1D蛋白质凝胶电泳的常见问题呢？（举个例子：NuPAGE™ Bis-Tris胶的中性pH体系相较于传统Tris-甘氨酸体系的优势。）

不过想要做好蛋白电泳，光知道如何应对常规蛋白样本还不够。

工欲善其事，必先利其器。今天我们又要为大家带来新的实验贴士，祝你一臂之力。

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相信大家在进行蛋白电泳时，有时会需要分离特殊的蛋白样本，比如低分子量蛋白或多肽，高分子量蛋白，又或者是天然状态下的蛋白质复合物。

这时如果使用针对特殊蛋白优化的蛋白预制胶，就能达到事半功倍的效果，也不会浪费珍贵的样本。

本期，我们从赛默飞蛋白电泳支持中心的“特殊蛋白质凝胶电泳”版块中，精选了部分常见问题。如果你需要进行非变性电泳，或得到高/低分子量蛋白的高分辨率结果，就请看过来！

 现在让我们看看详细内容吧：

特殊蛋白样本电泳的常见问题

Q：在非变性条件下，使用NativePAGE™凝胶进行非变性电泳比使用Tris-甘氨酸凝胶具有哪些优势？

A：需要使用非离子去垢剂进行增溶的样品不能兼容传统的非变性Tris-甘氨酸PAGE，因为随着蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移，会将非离子去垢剂遗留在后方。当缺少非离子去垢剂时，蛋白质会聚集并在泳道顶部形成垂直线条。当进行蓝色非变性电泳（NativePAGE™凝胶）时，Coomassie™ G-250可显著减少蛋白质的聚集，分离膜上的蛋白质复合物，达到Tris-甘氨酸凝胶上得不到的效果。

此外，与Tris-甘氨酸系统的工作pH（pH 9.3–9.5）相比，NativePAGE™凝胶较低的工作pH（pH 7.5–7.7）有助于维持碱性pH敏感型蛋白质的非变性结构和活性。

Q：我的NativePAGE™凝胶在电泳过程中停止电泳了。你们能否提供帮助？

A：在NativePAGE™电泳期间，电流下降至低于1mA很常见。大部分电源会将此记录为“空载”错误并自动关闭，导致电泳停止。一些电源可通过禁用或关闭“负载检测”功能来避免上述情况的发生。

Q：你们推荐选择哪种转移缓冲液用于NativePAGE™凝胶转印？

A：我们推荐使用含20%甲醇的1X Tris-甘氨酸转膜缓冲液。Tris-甘氨酸转膜缓冲液可干扰蛋白质测序。因此，如果您想进行蛋白质测序，我们推荐使用无甘氨酸的转膜缓冲液，如1X NuPAGE™转膜缓冲液、0.5X TBE转膜缓冲液或CAPS缓冲液。

Q：为什么Tricine凝胶更适用于较小的蛋白质和多肽？

A：Tricine凝胶系统是Laemmli Tris-甘氨酸系统的改良版，对较小的蛋白质和多肽具有较好的分离效果。在Laemmli系统中，蛋白质“堆积”在多孔的浓缩胶中，存在于由凝胶缓冲液中的高迁移率 “先导”氯离子与电泳缓冲液中的低泳动率 “尾随”甘氨酸离子边界之间。这些堆积的蛋白质条带在到达分离胶后开始根据大小进行分离。但浓缩胶中十二烷基硫酸盐（DS）离子的连续积累会阻碍较小蛋白质（<10 kDa）的分离。DS堆积可导致DS离子与较小蛋白质发生对流混合，导致条带模糊和分辨率降低。DS离子与较小蛋白质的混合也会干扰后续的固定和染色步骤。

为解决该问题，我们提供了经过优化的Novex™ Tricine凝胶系统。该系统采用低pH凝胶缓冲液，并使用移动更快的三甲基甘氨酸代替甘氨酸作为尾随离子。很多在Tris-甘氨酸系统中随着堆积的DS微粒迁移的小蛋白质和多肽在Tricine凝胶系统中可以很好地与DS离子分离，得到更加清晰的条带和更高的分辨率。

Q：我使用你们的一种蛋白质凝胶进行蛋白电泳，结果看到V形的蛋白质条带。你们能否帮我排查原因？

A：出现V形蛋白质条带是因为样品中存在DNA。在SDS增溶步骤后，通过增加超声处理步骤来剪切DNA，可使上述问题消失或最小化。此外，使用超速离心可从样品中去除DNA。

Q：NuPAGE™Tris-乙酸凝胶能否用于非变性和变性电泳？

A：NuPAGE™ Tris-乙酸凝胶不含SDS，在与NuPAGE™ Tris-乙酸SDS电泳缓冲液和NuPAGE™ LDS样品缓冲液配合使用时，可用于变性凝胶电泳；在与Novex™ Tris-甘氨酸非变性电泳缓冲液和Novex™ Tris-甘氨酸非变性样品缓冲液配合使用时，可用于非变性凝胶电泳。

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