本文来自《中药药理与临床》2012,28(05)
蛋白质组学在中药药理研究中的应用
陆洁，刘静，申秀萍
( 天津药物研究院天津市新药安全评价研究中心，天津300193)
摘要 蛋白质组学从一个机体或一个组织、一个细胞等不同层次" 整体" 的蛋白质活动的角度来获得蛋白质水平上关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识，这种研究思路与中药多靶点调节的特征相一致。本文介绍蛋白质组学的发展概况及核心技术，着重综述近几年蛋白质组学在病证模型研究、中药药效学评价及相关机制研究、中药毒性研究等方面的进展。
关键词 蛋白质组学; 中药药理; 应用研究
基因研究是20 世纪生命科学的主线，基因是遗传信息的源头，但功能蛋白才是基因功能的执行体。蛋白质组( proteome)包含三种不同的含义: 一个基因组、一种生物/组织所表达的全套蛋白质，这个概念最先由Wilkins 和Williams 于1994 年提出，并于1995 年首次公开发表［1］。一个蛋白质组并不是一个基因组的直接产物，复杂的基因间相互作用，细胞内活动和环境的影响都会影响基因的表达及蛋白质的翻译后加工。在" 后基因组时代" ( postgenome era) 中，功能基因组学( functional genomics)成为研究的重心，蛋白质组学( protemonics) 则是其" 中流砥柱" ，其强调从整体上研究蛋白质的种类、相互作用以及功能结构，在细胞核生命有机体的整体水平上阐明生命现象的本质和活动规律。
1 蛋白组学概述
蛋白质组( protoeme) 是指在特定的时间和空间上，一个细胞基因组所表达的全部相应蛋白质，包括各种亚型及蛋白质修饰［2］。蛋白质组学( proteomics) 本质上指在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白的相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识，其研究内容不仅包括对各种蛋白质的识别和定量化，还包括确定它们的细胞内外的定位、修饰、相互反应、活性，和最终确定它们的功能。由于对全部蛋白质的研究非常困难，中国的科学工作者提出了一种全新的研究策略: 功能蛋白质组学( Functional Proteomics) ，其重点放在那些可能涉及到特定功能机理的蛋白质群体上，研究特定时间、特定环境和试验条件下基因组所表达的蛋白质［3］。
蛋白质组学的研究是快速的、高通量的，其宗旨是将组织或细胞所有蛋白( 至少是大部分) 分离与鉴定。采用二维电泳( two-dimension electrophoresis，2 -DE) 进行大规模蛋白质的分离，应用大规模样品处理系统，以高效液相色谱( high performance liquid chromatography，HPLC) 分析和荧光差异凝胶电泳( different in gel electrophoresis，DIGE) 、表面增强激光解吸\ 离子化飞行时间质谱( surface enhanced laser desorption /ionization time-offlight mass spectrometry，SELDI-TOF MS) 、电喷雾串联质谱( ESIMS/MS) 、肽质量指纹图谱( peptide mass fingerprinting，PMF) 与肽序列标签技术( peptide sequence taq，PST) 等高自动化系统，配合大型图像分析系统与软件及数据库，实现在最短的时间内处理最多的数据［4］。
2 蛋白质组学与中药药理研究
中药药理学( Pharmacology of Traditional Chinese Medicine，PTCM) 是在中医药理论指导下，运用现代科学技术，研究中药与机体( 包括病原体) 相互作用及其作用规律的科学。中药治疗疾病不是单纯以药物去直接对抗致病因子，而是调整机体的功能状态，增强机体的抗病能力。中药对机体功能状态的调整与调节基因表达及对表达产物进行修饰有关。中药复方药理研究强调中药复方组合后整体化学成分产生效应，涉及多层次、多靶点、多效性，验证或揭示与其功能相关的药理作用，重于阐明中医药理论( 病证模型) ，同时重视对毒性的研究。蛋白组学技术忽略了组织器官的解剖定位，从一个机体或一个组织、一个细胞等不同层次" 整体" 的蛋白质活动的角度来揭示机体活动的基本规律，这种研究思路与中医整体观和中药多靶点整合调节的特点不谋而合［5］，有利于在分子水平进行病证模型的研究，同时，利用蛋白质组学研究技术对中药复方进行多靶点的高通量筛选，可以将中药复方的多组分、多靶点、多途径特点与蛋白质表达相关联。
近年来，蛋白质组学技术被逐渐应用到中药药理研究领域．并取得了一定成果。主要在以下几个方面:
2． 1 病证模型的研究中医证候是辨证论治的基础和核心。"证" 是生命物质在疾病过程中具有时相性的本质的反映，是一种功能态，不断发展转化，很难定性、定量以及定位［6］。有学者认为［7］，"证" 的本质是基因型及其表达，体外能用肉眼观察到的症状和体征变化具有其分子基础，是基因及其在mRNA、蛋白质水平差异的外在表现。在证候理论指导下，运用功能蛋白质组学的方法，通过探讨证候，特别是同病异证或异病同证的蛋白质差异表达及翻译后的修饰情况，揭示与某一证候形成相关的所有蛋白质及其特征，在整体蛋白质表达的水平上阐明证候的本质，则可称为证候蛋白质组学［8］。中药药理动物模型是中药实验药理的研究基础，尤其是" 证" 的动物模型的建立对在中医理论指导下进行中药的药理学研究至关重要，将蛋白质组学应用于" 证" 的动物模型研究，探索蛋白质表达图谱与中医分型的系统的、有规律的联系，为中医理论指导下病证模型的建立提供客观量化评价的可能。
王勇等［9］采用双向凝胶电泳和基质辅助激光解析/电离-飞行时间质谱( MALDI-TOF) 初步发现中华小型猪心肌缺血血瘀证模型存在的差异蛋白主要是氧化应激蛋白及相关的心肌结构蛋白，包括热休克蛋白27( HSP27) 、过氧化物酶( peroxiredoxin3 isoform 1) 、心肌肌钙蛋白T( cTnT) 、肌球蛋白( myosin light polypeptide) ，为临床冠心病心肌缺血血瘀证药物治疗提供可能的靶标。刘涛等［10］采用双相电泳对左冠状动脉前降支结扎法制作的气虚血瘀证模型心肌组织蛋白进行分离，质谱分析差异蛋白。结果显示，模型组存在18 个差异蛋白，其中4 个表达上调，l 4 个表达下调． 肽质指纹图谱分析结果，下调的为Malate Dehydrogenase 1，NAD( 苹果酸脱氢酶) 、NADH dehydrogenase FeS protein 8( NADH 脱氢酶，铁硫蛋白) 、myosin， light polypeptide 3( 肌浆球蛋白轻链) 、Cu-Zn superoxide dismutase( 铜锌超氧化物歧化酶) 、Gpxl protein( 谷胱甘肽过氧化物酶) ; 上调的为alpha B-crystallin( αB-晶状体蛋白) 、Protease ( prosome，macropain) 28 subunit( 蛋白酶前体或仅亚基) 、Tpil protein( 酸丙糖异构酶) 。气虚血瘀证实质可能与能量代谢障碍、氧化损伤和应激反应有关。战丽彬等［11］通过双向凝胶电泳分离脾阴虚证大鼠海马蛋白质组初步筛选出脾阴虚大鼠海马蛋白质组的差异表达，发现脾阴虚组海马蛋白质组中有6 个明显的差异蛋白点，其中5 个蛋白点表达明显下调，1个表达显著上调，并推测这些差异表达与学习记忆相关。苗兰等［12］采用复合方法制作大鼠气滞血瘀动物模型，用双向凝胶电泳分离模型动物血清的蛋白质，发现气滞血瘀证大鼠血清与正常相比有1 个蛋白质下调，5 个蛋白质上调，1个蛋白表达缺失。初步寻找与该证候形成相关的分子生物学基础。李炜等［13］以正常组为参比，研究肝阳上亢证大鼠肾上腺中的差异蛋白质，发现模型组有33 个蛋白质上调和6 个蛋白质下调，质谱鉴定出其中6 个蛋白质为GrpE 蛋白同系物1、60kDa 热休克蛋白、脂酰辅酶A 脱氢酶、钙网织蛋白前体、醛脱氢酶、异戊酰辅酶A 脱氢酶。钟小兰等［14］采用束缚制动法制备肝郁证大鼠模型，对获得的蛋白质进行二维凝胶电泳( 2-DE)分离、胶体染色，分析模型组和对照组蛋白质分子的差异表达，并以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱( MALDI-TOF-MS) 检测肽质量指纹，在数据库中检索出相应的蛋白质。在大鼠肝组织胶体考染的2-DE 图谱上，约能辨识出300 余个清晰的蛋白质斑点，指出肝主疏泄功能的正常可能和实体肝组织中的特异表达蛋白质--芳基硫基转移酶、烯酰辅酶A 水合酶和转甲状腺素蛋白的不同表达密切相关。
从以上研究成果可见，将蛋白质组学应用于病证动物模型研究，有助于揭示证候产生的物质基础和科学内涵。这些蛋白质组表达的异常，往往可能是中医药的作用靶点，这为更加清晰地诠释中药药效的作用机制，提供了新视野和新途径。
2． 2中药药效学评价及相关机制研究中药含有多种化合物，其疗效通过作用于人体的生物分子及结构的各级系统来实现。蛋白质组学等平行分析技术正好与中药的多成分、多靶点作用、多代谢途径的特点相契合。通过蛋白质表达谱的差比性分析，还可以揭示中药复方的作用靶点、作用环节和作用过程，发现复方中的有效成分及各成分间的协同关系，进一步实现复方的优化组合［15］。
宋健等［16］应用1D-PAGE 凝胶电泳、1D Advanced American Biotechnology( ABB) 研究金银花对流感病毒致小鼠流感模型血清中部分功能蛋白表达的相关性，分析小鼠血清蛋白质，得到8个主要蛋白质点，有3 个点在不同实验组间差异较大，从整体上说明了金银花及流感病毒对小鼠血清中部分功能蛋白的表达有密切相关性。申定珠等［17］采用2-DE、基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱及数据库查询对一贯煎作用于CCl4-橄榄油溶液制备大鼠肝硬化模型后模型动物蛋白质表达进行分析，鉴定出与氧化应激相关的差异表达蛋白质为铜/锌超氧化物歧化酶( Cu /Zn superoxide dismutase，Cu /Zn SOD) 、DJ-1、谷胱甘肽合成酶、谷胱甘肽S-转移酶Yb-1 亚基、醛酮还原酶7、A2，推测一贯煎治疗CCl4大鼠肝硬化的主要机制可能与提高抗氧化应激功能相关蛋白的表达有关。王继生等［18］采用二维电泳等蛋白质组学技术研究茅莓总皂苷对脑缺血/再灌注大鼠脑组织差异蛋白的影响，茅莓总皂苷组找到29 个差异点，其中18 个蛋白点表达上调， 11 个蛋白点表达下调，鉴定其中7 个蛋白: 5 个表达上调，2个表达下调。茅莓总皂苷对脑保护作用及抗损伤修复机制的机制是多个蛋白质共同参与的结果。宋元英等［19］观察黄芩苷、栀子苷、胆酸、珍珠母分别干预缺血再灌小鼠模型3h后蛋白表达差异，显示这些中药组分对5373Da、5707Da、15103Da 三个靶点的蛋白表达产生影响。刘建仁等［20］初步认为阻凝蛋白重链ⅡB、磷脂谷胱甘肽过氧分酶及泛素化酶E2( MW: 17kd) 这三种蛋白质在大鼠激素性骨坏死的发病及中药治疗过程中发挥着重要调控作用。黄黎明等［21］应用双向电泳图谱发现山茱萸提取物对用右旋糖酐作为抗原诱发的小鼠IgA肾炎有改善肾功能、缓解肾脏损伤的作用。并伴随一系列肾脏蛋白质表达水平的改变，其差异蛋白可能参与了肾脏炎症过程。姜楠等［22］以2-DE 分析动物下丘脑蛋白质组，探究桂皮醛对酵母致热大鼠模型解热作用机制与多个表达差异的蛋白质点有关，为寻找可能得体温调节关键酶活性改变相关的蛋白质点奠定了基础。马增春等［23］采用60 Coγ 射线全身照射小鼠，建立血虚证模型; 以双向电泳测定四物汤对血虚证小鼠血清中有影响的蛋白四物汤治疗血虚证的分子作用机理可能通过对血虚证模型小鼠血清中蛋白的影响而促进骨髓造血、减轻辐射引起的损伤。
张珍等［24］利用2-DE 和MALDI-TOF-MS 对黄芩苷干预后永生化人表皮角质形成细胞HaCaT 的总蛋白进行分析，从18 个差异蛋白质点中获得热休克蛋白β-1、肌动蛋白、二氢嘧啶酶调节蛋白等15 个点的肽质量指纹图，表明黄芩苷可通过影响细胞中多种蛋白的表达，增强细胞的稳态和抵抗环境刺激损伤的能力，发挥抗肿瘤活性。罗佩谊等［25］利用SILAC 蛋白质组学方法探讨白藜芦醇抗皮肤鳞状细胞癌生物效应和分子机制，鉴定了11 个受白藜芦醇调控的蛋白质分子，其中BAG1，PDCD11，BCLAF1，HSPA9，YWHAZ 等5 个细胞凋亡相关蛋白被发现受白藜芦醇调控。曾建春等［26］以蛋白质组学研究方法分析杜仲含药血清诱导骨髓间充质干细胞( Mesenchymal stem cells，MSCs)定向分化为成骨细胞过程中的差异蛋白表达，结果显示，杜仲可能通过过上调波形蛋白、核纤层蛋白A 的表达促进细胞分化，下调钙网织蛋白表达，释放细胞内钙，参与钙结节的形成，与体内骨矿化过程有关。张明智等［27］ 研究夏枯草提取物作用于Jurkat 细胞后蛋白质组学的变化，寻找差异表达的蛋白。结果表明，夏枯草提取物可显著抑制Jurkat 细胞生长，并引起Jurkat细胞蛋白质组学的改变，且应用双向电泳和质谱成功鉴定了11个蛋白质，这可能是夏枯草提取物抗肿瘤作用的机制之一。马增春等［28］采用TNF-α 刺激的血管平滑肌细胞来建立体外平滑肌细胞功能失常的细胞模型，利用双向电泳、质谱鉴定等技术，在分子水平上探讨复方丹参方治疗动脉粥样硬化可能的作用机制。结果显示，复方丹参方可逆转TNF-α 作用于血管平滑肌细胞引起的16 个蛋白质下调和24 个蛋白质上调，下调钙调蛋白依赖蛋白激酶、N． ras、基质金属蛋白酶9 的水平，上调p53 肿瘤抑制因子、周期素依赖激酶抑制因子p21 的水平。
将中药或其提取物作用于动物模型或细胞，结合蛋白质组学技术，通过对用药前后组织或细胞的差异蛋白质组展示来评价中药的药效。同时，针对其中特异表达或差异表达显著的蛋白点进行更深一步的后续质谱鉴定研究，确定药物作用的靶蛋白，这种全景式分析研究方法必将大大加速中药活性筛选过程［29］，推动中药药效研究的进一步深化。
2． 3中药毒性研究中药与西药的最大区别就是中药的成分非常复杂，所含的成分现在还很难全部分析清楚。各种成分之间相互作用、相互制约，进入到人体后作用于多种靶器官，其药效和毒性的表现不能简单地从某一个或几个已知成分的含量来判断。运用中医的思维方式，结合蛋白质组学技术，揭示中药产生毒性作用的机制，找出其关键环节和作用靶点，予以干预，可达到减轻其毒性作用的目的。
郭京艳［30］采用二维凝胶电泳分离肝脏蛋白样品，以飞行时间质谱、生物信息学分析等方法鉴定相思豆毒素中毒小鼠肝脏差异表达蛋白。结果显示，小鼠相思豆毒素中毒后共鉴定出11个明显变化的肝脏差异表达蛋白。小鼠相思豆毒素中毒后，发生变化的肝脏蛋白多数为具有凋亡诱导、能量代谢、增殖和分化等作用的功能性蛋白，其分子毒理涉及复杂的网络信号传导机制。孙世仁等［31］采用马兜铃酸腹腔注射制备大鼠慢性马兜铃酸肾病模型，建立模型组和正常组大鼠肾组织的双向电泳图谱，并认为所发现的这些差异蛋白质可能介导了马兜铃酸的毒性作用。
利用蛋白质组学技术将能够发现大量与药物毒理研究有关的标志物及疾病诊断的标志物，并且能够利用所鉴定的标志物预测药物毒性。蛋白质组学技术在中药毒性研究中的应用，仍处于初步的认识和探索阶段，尤其是近几年频频报道出中药注射液在临床的不良反应［32］，因此，利用蛋白质组学技术对中药药物毒性的研究还有更多系统化的工作需要进行。
3 思考与展望
人类基因组计划的实施，带动了蛋白质组学的发展，极大地推动了现代生物技术及其相关学科的迅猛发展，也为中药药理的现代化研究提供了新方法、新思路、新契机。蛋白组学技术自身仍存在许多不可忽视的问题，操作较烦琐、对某些低丰度蛋白分辨率不高，需要进行改进和提高。此外，在蛋白组学的研究过程中，会获取海量数据，应用于中药药理研究，如何做出科学合理的分析得出结论，仍是难点。在中医理论指导下，运用蛋白质组学等现代科学技术，深入研究病证动物模型、中药的毒性、药效物质基础和作用机制，科学地揭示中医病证模型，揭示多组分、多途径、多靶点的药理综合效应，最终用一组基于蛋白质功能变化的综合生物学效应来阐明药效机制。可以预见，在后基因组时代，随着大量的疾病相关基因被发现，必然会加快中药药理的发展进程及中医药研究的科学化脚步。
参考文献：略
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10.证候研究与流行病学
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