慢病毒生产工艺规模放大的挑战

慢病毒（LV）是极具吸引力的基因递送载体，因其具有多种优势，包括可转导分裂和静止细胞，且LV载体相比其它病毒载体更加安全，因其免疫原性和毒性以及插入性致突变/癌变的几率均相对较低。LV还可利用来自其它病毒的囊膜蛋白形成假型，从而提高病毒颗粒的稳定性，并使载体具有更宽泛的组织趋向性或靶细胞特异性。这些特性使LV成为多种疾病治疗方法的首选载体，如CAR T细胞治疗。

LV应用不断扩展，使得对高浓度、大体积LV的需求不断增加，以用于临床前及临床试验。目前，最常使用的是源于人体免疫缺陷病毒-1（HIV-1）的慢病毒载体。尽管在实验室的体外实验和小动物体内实验使用中，LV的小规模生产已有常规性的制备方法，但是大规模的生产仍有不小挑战。规模放大的主要挑战包括用于瞬时转染的贴壁细胞系本身的限制性特性，以及下游工艺（DSP）的挑战，后者会极大地阻碍LV载体上清液的大体积处理，因其既需要维持载体的功能性，同时又需使损失最小化。

慢病毒包装细胞系

大多数情况下，LV生产使用贴壁HEK 293/293T 细胞系的多质粒瞬时转染，以含胎牛血清的培养基，在单层的细胞培养瓶或多层的细胞工厂内培养。传统上，磷酸钙共沉淀被用于LV的生产，但是，这种方法不易规模放大，因其需要大量的DNA、且需要血清或白蛋白以降低CaP的细胞毒性，对pH的变化极度敏感。为降低CaP毒性对细胞的影响，需要在转染后更换培养基，这在大规模生产时，从操作性或经济性上考虑，可行性均较差。CaP在悬浮培养的动态条件下，也不是一种非常有效的方法。

已有多种替代性方法可用于载体的生产，包括阳离子聚合物，如PEI以及基于阳离子脂质的试剂，如lipofectamine。PEI是相对较经济的方法，其不需要对转染条件进行过多的调节，且毒性较CaP低，也就意味着转染后不需要更换培养基，此外，PEI在有/无血清条件下，均可有效转染贴壁和悬浮培养。

尽管相比稳定生产方法，瞬时转染更快、更高效，但是由于其显著的批间差，所以不是大规模生产的优化选择，它还需要大量的质粒，终产物也存在被具有免疫原性的残留质粒DNA污染的可能性。对于临床前和临床研究，瞬时转染足以，但是对于GMP级生产，可能需要生产具有稳定质量的载体。

细胞培养的规模放大

▌贴壁细胞

现有的用于瞬时转染的贴壁细胞系可放大性有限，因为细胞的贴附需要较大的表面积。此外，由于在生物安全柜内操作大量的细胞培养瓶非常耗时耗力，也天然地限制了贴壁细胞培养的可放大性。

 

进行中等程度的规模放大可使用多层表面的培养系统，如滚瓶、多层培养瓶以及细胞工厂，但是这些技术也有其限制，因其是低细胞密度培养系统，所以只能通过增加培养单元的数量来进行“规模扩展”，这就需要相当大的占地空间，操作也较费力。

▌ 悬浮细胞

为克服贴壁细胞对较大贴壁表面积需求，以及简化细胞培养操作，一种方法是将贴壁LV生产细胞驯化为悬浮培养。相比贴壁细胞，悬浮细胞可使用摇瓶、搅拌式生物反应器或波浪式生物反应器，相对简单地进行规模放大，并可达到更高的细胞密度，而不需要贴附表面。悬浮细胞可使用无血清培养基培养，所以更适合临床级产品的生产，降低了终产物被潜在免疫原性外源物和动物源性成分污染的风险，并可简化下游工艺。将“二维”的规模扩展（scale out）贴壁培养技术，替换为规模放大悬浮培养工艺，还可降低病毒批次间的差异性。

目前，悬浮细胞培养方法已可规模放大至50L及以上规模，并成功用于慢病毒的生产。也有报导使用在基于灌流的生物反应器系统内，通过悬浮培养的HEK 293细胞系的瞬时转染来生产慢病毒。

慢病毒载体的下游工艺

病毒纯化和浓缩工艺的选择和整合是成功进行临床级治疗性载体大规模生产的前提。而目前，生产高滴度、高纯度的慢病毒仍有不小的挑战。对于需规模放大的应用，选择的技术需满足一系列的基本标准：可规模放大、经济、具有高处理能力和通量、可有效去除杂质、维持病毒的功能性、降低在每个步骤的病毒颗粒的损失。

 

▌ 层析

层析是病毒载体纯化最常用和基本的方法，包括体积排阻层析、阴离子交换层析、亲和吸附层析以及复合模式层析等。

阴离子交换层析（AEX）时，将病毒上清液通过层析柱，带负电荷的病毒颗粒结合至带正电荷的层析基质。结合的病毒颗粒然后用高盐溶液从层析柱洗脱。阴离子交换层析是一种相对较为直接的方法，可获得高纯度的载体，收率一般可达~70%，其缺点是病毒颗粒洗脱液是高盐浓度缓冲液，可能会降低载体的感染性，原因可能是渗透压的增加，破坏了膜结构。

体积排阻层析（SEC）也称为凝胶过滤，通过多孔的、非吸附性材料，基于尺寸和质量，从中度的污染物中分离病毒颗粒。感染性颗粒收率一般可达到~70%，载体纯度可达到>90%。SEC特别适合于不稳定的病毒颗粒，因其纯化过程中使用的条件相对温和。但SEC通量一般较低，需要较低的线性流速，增加了处理时间。通过SEC获得的病毒颗粒通常需要进一步的浓缩，因为从层析柱流穿的病毒通常会被稀释。

亲和吸附层析是相比较经济的方法，被广泛用于生物制药行业分离生物分子。亲和层析时，将LV上清液上样至层析柱，病毒颗粒结合至固定在层析胶上的配基，然后通过特定溶液，使颗粒解吸附。亲和层析的操作相对复杂，而且，诸如细胞性蛋白之类的杂质会与载体颗粒竞争结合位点，降低层析柱的结合能力。

复合模式层析通常会结合至少2种层析机制，以达到产物的精制纯化，如常用于慢病毒载体纯化的Capto Core 700层析介质，具有大小分离以及吸附层析的双重功能。

▌ 超速离心

超速离心是一种传统的浓缩方法，一般用于初步纯化之后，以获得小体积的高滴度载体。超速离心可显著提高浓度，这在需要获得极低体积料液时，非常实用。但对于小到中等规模的应用，超速离心天然具有难以规模放大的问题，因其受限于离心机转子容量，单次运行所能处理的体积有限。超速离心的操作也非常耗时，还会导致杂质的共浓缩，导致载体性能的抑制。

▌ 切向流过滤

切向流过滤（TFF）通过将病毒上清液切向泵过膜表面，利用膜孔径进行分离。TFF可以用于起始料液的澄清步骤，也可以用于下游的精制步骤。在精制步骤中，膜两侧的压力差可驱使比膜孔径的小的颗粒通过过滤膜，如蛋白质和DNA，而截留载体颗粒，其随回流液循环回流至进样容器，从而被浓缩。与传统直流过滤不同的是，截留的颗粒不会积聚在膜表面上，所以可以防止污染，并处理更大体积的料液。TFF被证明是高效纯化慢病毒的方法，可获得较高的载体收率。由于其高通量和高处理能力，TFF也非常适合LV生产的规模放大。

LV质量分析

生产人体使用的GMP级LV载体产品需要对终产物进行严格的鉴定，以建立其纯度、效价和安全性特性。LV有不同的体外和体内应用范围，所以，生产方法和最终产物的质量要求取决于目的用途。用于临床使用的LV载体需在经GMP认证的厂方内生产。

 

▌ 纯度

 

要获得高滴度、纯度和浓度的临床级LV不是一个简单的任务，一个参数的优化往往伴随着其它参数的妥协。为达到更高的纯度，通常需要增加纯化步骤的数量，而每一步都可能增加病毒颗粒的损失或破坏。但尽管如此，临床级载体必需经过特定的纯化处理，以满足一系列的质量控制评估要求。

 

每个载体批次都必需进行测试，以确保污染物低于可诱导接受者毒性和免疫反应的水平。宿主细胞和培养基来源的蛋白质杂质可通过一系列的方法进行评估，包括SDS-PAGE、Bradford和Lowry法蛋白质分析、针对特定蛋白质杂质的Western Blotting以及商业化的酶联免疫吸附检测（ELISA）试剂盒。生产细胞的污染性DNA序列，如SV40大T抗原和不需要的质粒DNA序列（如VSV-G和gag-pol）可使用定量PCR确定。总DNA含量可使用荧光光度法检测。此外，必需进行标准的无菌性检测，以确保每个载体批次无内毒素和外源性物质，包括细菌、支原体和真菌等。还需进行理化特性的分析，如pH和渗透压，以确保最终载体批次符合临床标准。

 

▌ 效价

 

与其它药用产品相比，生物药的批间差可能会相对较大，如基于病毒颗粒的载体，特别是考虑到总载体颗粒和功能性载体颗粒的比（效价）。在临床背景中，终产物的每个批次必需一致，所以必需对功能性和非功能性病毒颗粒进行定量，以确保单位剂量具有一致的转导效率。如果缺陷颗粒与功能性颗粒的比例过高，整个批次需被认定为不合格。

 

目前，LV滴度检测方法包括在细胞转导后评估报告基因的表达，上清液中总RNA的定量（RNA滴度）以及评估在转导细胞中的载体DNA（DNA滴度）。对于研发型载体，检测转导细胞中的转基因表达是一种相对简单的方法，当载体携带一个报告基因时，即可进行，如GFP或LacZ，但是这种方法不能区分含有多个载体拷贝的细胞，也不适合用于检测治疗性基因载体的滴度。病毒性上清液中的RNA滴度是最快速的方法，但由于受到缺陷型病毒颗粒以及生产中夹带过来的DNA的干扰，而不能准确反映功能性滴度。尽管相对耗时，对整合至转导细胞基因组中的前病毒DNA进行定量，可对功能滴度进行最可靠的评估，因其可检测单个细胞中的多个载体拷贝，也会计入缺陷型载体颗粒和污染性质粒DNA等因素。

 

▌ 安全性

 

在复制缺陷型慢病毒情况下，必需进行生物学分析，以确定没有发生同源重组。每个载体批次必需检测复制完整的慢病毒（RCL），而如果检测到，整个批次需驳回。灵敏的分析方法需能检测RCL，即使重组情况极少发生。因为LV的安全特性已经过特殊设计，可防止重组，正因如此，目前还没有关于在载体系统中RCL的报导。

 

已经开发了不少方法用于监测RCL。传统的基于细胞的分析需要使用载体样品，对允许病毒感染的细胞系进行转导，并经传代之后，扩增潜在的RCL。然后，使用ELISA方法监测每个传代阶段，培养上清液中的HIV-1 p24衣壳蛋白浓度；如不存在RCL，p24的浓度应随时间降低。另外，灵敏且快速的PCR技术也可以用于监测RCL，包括检测反转录酶活性的产物增强反转录酶（PERT）分析法、用于VSV-G囊膜DNA的实时PCR分析法、以及检测转移载体和gag-pol质粒之间重组的psi-gag PCR分析。

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小编出于交流目的翻译、编辑此文，因水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。

原文：A.McCarron, M.Donnelley, C.McIntyre, et al., Challenges of up-scaling lentivirus production and processing. Journal of Biotechnology, 2016, 240:23-30.

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